3-酰胺基-吲哚類衍生物及其有關物質含量測定*

申冬妮,楊建云,肖炳坤,黃榮清

(軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所,北京 100850)

·藥物制劑與藥品質量控制·

3-酰胺基-吲哚類衍生物及其有關物質含量測定*

申冬妮,楊建云,肖炳坤,黃榮清

(軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所,北京 100850)

目的 建立反相高效液相色譜法測定3-酰胺基-吲哚類衍生物及其有關物質含量。方法采用Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱,流動相為甲醇∶乙腈∶水(43∶12∶45),流速1.0mL·min-1;檢測波長224 nm;進樣量20μL;柱溫:室溫。結果3-酰胺基-吲哚類衍生物與有關物質能達到較好分離,在0.04～0.16 mg·mL-1濃度范圍內與峰面積線性關系良好,r=0.999 7;方法重復性RSD為0.52%;檢測限為2.65 ng。結論該方法準確可靠,靈敏度高,專屬性好,可用于3-酰胺基-吲哚類衍生物及其有關物質含量測定。

3-酰胺基-吲哚類衍生物;色譜法,高效液相;含量測定

抑郁癥是一類嚴重危害人類身心健康的常見精神疾病,主要表現為情緒低落,興趣喪失,思維遲鈍,意志行為減少,嚴重者伴有自殺觀念和行為。當前世界十大疾病中,抑郁癥名列第五位,其患病率已經超過了人們認為很常見的咽喉炎和冠心病,而且預計到2020年將躍升到第二位[1-2]。3-酰胺基-吲哚類衍生物為本所合成的褪黑素類衍生物,可以增加褪黑素受體親和性,有抗抑郁的作用。筆者建立了簡便、準確的高效液相色譜(HPLC)分析方法,用于測定3-酰胺基-吲哚類衍生物含量及其有關物質,為其質量的可控奠定了基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695-2996高效液相色譜儀(四元泵,二極管陣列檢測器,自動進樣器,Empower色譜工作站)。

1.2 試藥 甲醇和乙腈均為色譜純,水為娃哈哈純凈水。3-酰胺基-吲哚類衍生物對照品(軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所自制,含量:99.6%)；3-酰胺基-吲哚類衍生物供試品(軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所自制,批號分別為20121011,20121015, 20121018)。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品儲備液 取3-酰胺基-吲哚類衍生物對照品約20 mg,精密稱定,置50 m L量瓶中,加適量流動相超聲助溶,冷卻至室溫,加流動相稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備液。

2.1.2 對照品溶液 取對照品儲備液2 mL至10 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度搖勻,作為對照品溶液。

2.1.3 供試品儲備液 取3-酰胺基-吲哚類衍生物供試品約10 mg,精密稱定,置25 m L量瓶中,加適量流動相超聲助溶,冷卻至室溫,加流動相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品儲備液。

2.1.4 供試品溶液 取供試品儲備液2 mL至10 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度搖勻,作為供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統適用性實驗 采用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱；流動相:甲醇-乙腈-水(43∶12∶45)；檢測波長224 nm；流速1.0 m L·min-1；進樣量20μL；柱溫:室溫。理論板數以3-酰胺基-吲哚類衍生物計算不低于5 000。

按上述色譜條件,將對照品溶液、供試品溶液各20μL分別進樣,3-酰胺基-吲哚類衍生物的保留時間約為14 min,主峰與有關物質峰能得到良好分離(R＞1.5)。見圖1。

A.3-酰胺基-吲哚類衍生物對照品;B.3-酰胺基-吲哚類衍生物供試品;1.3-酰胺基-吲哚類衍生物圖1 兩種溶液的HPLC色譜圖A.3-amido-indole derivative control solution；B.sample solution of 3-amido-indole derivatives；1.3-amido-indole derivativesFig.1 HPLC chromatogram of two solutions

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 取“2.1.1”項下對照品儲備液1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0 mL置10 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度搖勻,得一系列濃度的標準溶液。分別取20μL進樣測定,記錄色譜圖[3]。以峰面積(A)為縱坐標,以濃度(C,mg·mL-1)為橫坐標繪制標準曲線,得回歸方程(n=7):A=1×108C-4.18×104,r=0.999 7。結果表明,3-酰胺基-吲哚類衍生物在0.04～0.16 mg·mL-1濃度范圍內與峰面積呈良好線性。

2.3.2 重復性實驗 分別取供試品(批號: 20121011)6份及對照品2份,精密稱定,照“2.2”項操作,按外標法以峰面積計算樣品含量,含量分別為100.8%,101.3%,101.5%,101.4%,102.0%, 101.5%,平均含量為101.3%,RSD為0.52%。

2.3.3 檢測限與定量限 精密吸取“2.1.1”項對照品儲備液,加流動相逐級稀釋,進樣,記錄色譜圖,在信噪比(S/N)為3∶1時測得檢測限為2.65 ng,在S/N為10∶1時測得的定量限為10.6 ng。

2.3.4 樣品含量測定 按“2.1”項的方法分別制備對照品溶液和供試品溶液,各取20μL進樣,按外標法以峰面積計算樣品含量,結果表明,3批樣品主峰含量均＞99.0%(表1)。

表1 3批樣品的含量及有關物質測定Tab.1 Content determ ination and related substances of 13 batches of sam p les %,n=3

2.3.5 有關物質測定 取“2.1.3”項的供試品儲備液,精密移取此溶液適量,用流動相稀釋100倍,得自身對照溶液。以不加校正因子主成分自身對照法計算有關物質的含量。結果表明,有關物質均＜1%(表1)。

2.3.6 方法專屬性考察

2.3.6.1 酸破壞 取“2.1.3”項供試品儲備液2 mL置10 mL量瓶中,加1 mol·L-1鹽酸3 mL,靜置15 h,用1 mol·L-1氫氧化鈉中和,加流動相稀釋至刻度搖勻,作為酸破壞樣品,照“2.2”項色譜條件,取20μL進樣,記錄色譜圖。見圖2。

2.3.6.2 堿破壞 取“2.1.3”項供試品儲備液2 mL置10 mL量瓶中,加1 mol·L-1氫氧化鈉3 mL,靜置17 h,用1 mol·L-1鹽酸中和,加流動相稀釋至刻度搖勻,作為堿破壞樣品,照“2.2”項色譜條件,取20μL進樣,記錄色譜圖。見圖3。

2.3.6.3 氧化破壞 取“2.1.3”項下供試品儲備液2 mL置10mL量瓶中,加30%過氧化氫溶液3mL,靜置12 h,加流動相稀釋至刻度搖勻,作為氧化破壞樣品,照“2.2”項的色譜條件,取20μL進樣,記錄色譜圖。見圖4。

1.3-酰胺基-吲哚類衍生物圖2 供試品溶液酸破壞實驗的HPLC色譜圖1.3-amido-indole derivativesFig.2 HPLC chromatogram of the sam p le solution in acid damage experim ent

1.3-酰胺基-吲哚類衍生物圖3 供試品溶液堿破壞實驗的HPLC色譜圖1.3-amido-indole derivativesFig.3 HPLC chromatogram of the sam p le solution in base damage experim ent

2.3.6.4 高溫破壞 取供試品適量,平鋪于干凈的稱量瓶內,敞口放置于120℃烘箱內,3 h后取出放至室溫,稱取供試品10 mg,精密稱定,置25 mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度搖勻,作為高溫破壞樣品,照“2.2”項的色譜條件,取20μL進樣,記錄色譜圖。見圖5。

結果表明供試品經酸、堿、氧化、高溫破壞后,所建立的高效液相色譜法能夠使3-酰胺基-吲哚類衍生物與有關物質較好分離,說明該方法專屬性好。

3 討論

3.1 波長的選擇 經二極管陣列全波長掃描,得主峰的最大吸收波長為224.0 nm,有關物質的最大吸收在225.2 nm,因此選擇224 nm作為檢測波長。

1.3-酰胺基-吲哚類衍生物圖4 供試品溶液氧化破壞實驗的HPLC色譜圖1.3-amido-indole derivativesFig.4 HPLC chromatogram of the sample solution in oxidative damage experiment

1.3-酰胺基-吲哚類衍生物圖5 供試品溶液高溫破壞實驗的HPLC色譜圖1.3-amido-indole derivativesFig.5 HPLC chromatogram of the sam p le solution in high temperature damage experiment

3.2 流動相的選擇 考察了甲醇-水系統作為流動相,在甲醇∶水=55∶45時,主藥與有關物質分離良好,但在此條件下考察高溫破壞樣品時,主峰與新破壞出的雜質峰未分開,為縮短分析時間及改善分離度,加入乙腈進行調節,經摸索進行比例調節,最終確定甲醇、乙腈和水的比例為43∶12∶45。

[1] 王祖承.精神病學[M].北京:人民衛生出版社,2002: 112-125.

[2] KENNEDY SH.A review of antidep ressant treatments today [J].Eur Neuro Pharm,2006,165(4):619-624.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄195.

DOI 10.3870/yydb.2014.05.031

Determination of Contents 3-amide-indole Derivative and Related Substances

SHEN Dong-ni,YANG Jian-yun,XIAO Bing-kun,HUANG Rong-qing
(Institute of Radiation Medicine, Academy ofMilitary Medical Science,Beijing 100850,China)

ObjectiveTo establish a RP-HPLC method for the determination of 3-amide-indole derivative and its related substances.MethodsDiamonsil C18(250 mm×4.6mm,5μm)column was adopted.Themobile phase consisted of a mixture ofmethanol-acetonitrile-water(43∶12∶45)at the flow rate of 1.0 mL·m in-1.The wavelength for ultraviolet detection was 224 nm.The injection volume was 20μL and the column temperature was room temperature.Results3-amide-indole derivative and related substances could be well separated.The linearity of the 3-amide-indole derivative curve waswell correlated (r=0.999 7)within the range of 0.04-0.16 mg·mL-1.The RSD was 0.52%with good repeatability.The detection limitwas 2.65 ng.ConclusionThemethod is accurate,reliable,sensitive and specific,which can be used for the determination of 3-amide-indolederivative and related substances.

3-amide-indole derivative;Chromatography,high performance liquid;Contents determination

R971.43;R927.2

A

1004-0781(2014)05-0650-03

2013-03-05

2013-05-07

*國家自然科學基金項目(81072613)；“十二五”國家科技重大專項“重大新藥創制”綜合性新藥研究開發技術大平臺(2012ZX09301003-001-010)

申冬妮(1980-),女,山西太原人,主管藥師,在讀碩士,研究方向:藥物分析。電話:(0)18190690827,E-mail:sdn2005@gmail.com。

黃榮清(1965-),男,江西人,研究員,研究方向:新藥質量標準。電話:010-66930217,E-mail:huangrq@tom.com。