固相萃取高效液相色譜法測定全血環孢素濃度

宋新文，汪洋，劉炘，彭靜，許瓊

(武漢市婦女兒童醫療保健中心，武漢 430016)

固相萃取高效液相色譜法測定全血環孢素濃度

宋新文，汪洋，劉炘，彭靜，許瓊

(武漢市婦女兒童醫療保健中心，武漢 430016)

目的 建立一種簡便的測定全血環孢素濃度的高效液相色譜法。方法以Venusil ASB C18為色譜柱,流動相為乙腈-水=70∶30,柱溫70℃,檢測波長為210 nm,進樣量200μL;全血樣品經10%尿素溶血處理離心后,取上清液直接上PRS-SPE柱,用等體積乙腈-四氫呋喃(80∶20)作為洗脫劑,收集洗脫液直接進樣測定。結果環孢素全血樣品線性范圍為30～3 500 ng·mL-1,低、中、高3種不同濃度(78.2,300.0,1 213.0 ng·mL-1)方法回收率分別為101.66%,104.06%,100.46%,日內、日間RSD均<5%。結論該方法準確性好,靈敏度高,樣品處理簡單,可滿足兒科臨床中環孢素全血濃度監測需要。

環孢素；固相萃取；色譜法,高效液相

環孢素是臨床上常用的免疫抑制藥,在成人主要用于器官移植后抗免疫排斥,在兒科臨床上多用于重型再生障礙性貧血和難治性腎病綜合征的治療,也可用于系統性紅斑狼瘡、噬血細胞綜合征等其他免疫性疾病。但是環孢素毒副作用大,治療窗較窄,藥物吸收個體差異大,臨床上往往需要通過監測其血藥濃度來實行個體化用藥,以減少其肝、腎毒性等不良反應和提高治療效果。因此,開發和建立一種能夠快速、準確地測定血液中環孢素濃度的檢測技術以指導安全合理使用環孢素就具有十分重要的臨床價值。

目前國內外測定環孢素血藥濃度的方法主要有熒光偏振免疫法和高效液相色譜法(HPLC)［1］。熒光偏振免疫法簡便、快速、靈敏,但其測定成本昂貴(需要依賴專用試劑),且該法易受代謝產物因素的干擾而使測定結果誤差較大。HPLC法具有特異性強、準確度高、成本低廉、易于推廣普及等優點,但文獻報道［2～4］大多采用液液萃取法等多重步驟提取,操作比較復雜,難以適應臨床常規監測的需要。為此筆者通過固相萃取處理樣品建立了HPLC法測定全血環孢素,用于小兒再生障礙性貧血及激素耐藥型腎病綜合征(難治性腎病)患兒環孢素全血濃度的監測,取得了滿意效果,現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀:包括G1311C二元色譜泵、G1316A柱恒溫箱、G1315D二極管陣列紫外檢測器(DAD)、Agilent1260化學工作站；WH-1微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；LDZ4-0.8A臺式離心機(北京醫用離心機廠)；AB204萬分之一電子分析天平(瑞士產)；Cleanert PRS丙磺酸強陽離子交換固相萃取柱(規格:每支200 mg；Agela Technologies公司生產)。

1.2 試藥 環孢素對照品(上海梯希愛化成工業發展有限公司,批號:K4J6E-DA)；乙腈(國藥集團化學試劑有限公司,批號:20120629,色譜純)；正常空白全血(實驗室自制)；0.9%氯化鈉注射液(武漢濱湖雙鶴藥業有限責任公司,批號:120704-201)；尿素(天津鴻鑫化學試劑有限公司,批號:20110803),四氫呋喃(天津市光復精細化工研究所,批號:20120305)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Venusil ASB C18(4.6 mm× 200 mm,10μm)；流動相為乙腈∶水=70∶30；流速0.8 mL·min-1；柱溫70℃；檢測波長為210 nm；進樣量200μL。

2.2 標準溶液的制備 精密稱取環孢素對照品3.832 mg,用70%乙腈定容于10 m L量瓶,再取1 mL用70%乙腈定容于10 mL量瓶中,得到濃度為38.32μg·mL-1的對照液,作為①號對照液,然后按照倍比稀釋原則依次稀釋到⑧號,①～⑧號對照液濃度分別為38.32,19.16,9.58,4.79,2.40,1.20,0.60, 0.30μg·mL-1。

2.3 全血標本的處理 取全血樣品0.5 mL,加入10%尿素溶液1 mL,混合均勻,經12 000 r·min-1離心10 min,吸取上清液于PRS固相萃取小柱,待其自然瀝干后加入0.9%氯化鈉注射液3 mL進行淋洗,將固相萃取小柱于4 000 r·min-1離心2 min,最后用洗脫液(乙腈∶四氫呋喃=80∶20)0.5 m L上柱洗脫,收集洗脫液,取200μL進樣測定。

2.4 標準品和全血標本色譜圖 分別取空白全血樣品、含環孢素全血樣品及環孢素標準品進樣測定,記錄色譜圖。結果環孢素色譜峰與全血中內源性雜質峰能夠很好分離,無干擾峰出現,環孢素的保留時間約13 min,環孢素標準品、空白全血、含環孢素樣品及色譜圖見圖1。

圖1 3種樣品的HPLC圖A.空白全血;B.環孢素標準液;C.含環孢素全血樣品; 1.環孢素Fig.1 HPLC chromatogram of 3 kinds of sam p lesA.blank whole blood;B.cyclosporine standard solution; C.whole blood sample containing cyclosporine;1.cyclosporine

2.5 標準曲線制備 依次量取上述①～⑧對照液各0.1 mL加入到空白全血1 m L中,漩渦混合均勻,可得濃度依次為27.27,54.54,109.10,218.20,435.50, 870.70,1 741.80,3 483.60 ng·mL-1的工作全血標本,分別取0.5 mL按“2.3全血標本的處理”項下進行處理,記錄色譜峰面積,以峰面積A為橫坐標,以對照液濃度(C)為縱坐標,得直線回歸方程為C=A×3.1-0.5,r=0.999 9,最低檢測濃度為27 ng·mL-1

2.6 回收率及精密度實驗 分別配制低(78.2 ng·m L-1)、中(300.0 ng·m L-1)、高(1 213 ng·m L-1)3種不同濃度的環孢素全血樣品,每種濃度的樣品各取3份,照“2.3”項下操作,記錄色譜峰面積,如此連續操作3 d,根據工作標準曲線方程分別計算日內回收率及日間回收率,結果見表1。

表1 環孢素回收率和精密度測定結果Tab.1 Recovery and precision results of cyclosporine %

2.7 臨床標本檢測結果 32例次難治性腎病患兒及10例次再生障礙性貧血患兒,按4～8 mg·kg-1·d-1、每12 h 1次口服環孢素口服溶液,分別取服藥前全血樣本(谷濃度)及服藥2 h后全血樣本(峰濃度)測定,結果見表2。

表2 臨床標本檢測結果Tab.2 Determination results of clinical specimens ng·mL-1,±s

表2 臨床標本檢測結果Tab.2 Determination results of clinical specimens ng·mL-1,±s

項目例次谷濃度峰濃度難治性腎病32 71.6±41.7 559.8±143.3再生障礙性貧血10 155.5±66.4 1 125.0±343.1

3 討論

3.1 色譜條件的確立 環孢素是一種內含11個氨基酸的環狀多肽化合物,紫外吸收較弱,文獻［2～6］均以210 nm作為檢測波長,故本實驗也采用此波長。

由于環孢素相對分子質量大,脂溶性高,采用C18反相色譜柱分離時需用較高的柱溫才能使其有效分離,否則峰形很寬,呈丘陵狀。本實驗分別嘗試50, 55,60,65,70℃柱溫,發現隨著柱溫升高,峰寬逐步減小,峰形改善明顯,考慮到柱溫太高會影響色譜柱壽命,故最終確定柱溫為70℃。本研究使用的天津博納艾杰爾公司生產的Venusil ASB C18色譜柱,在80℃柱溫條件下可以連續使用100 h,故在70℃條件下間斷運行是完全可行的。

環孢素在全血中的濃度較低,在激素耐藥型腎病綜合征(難治性腎病)患兒其有效谷濃度一般維持為100～200 ng·mL-1［7］,而在再生障礙性貧血患兒有效谷濃度為200～400 ng·mL-1［8］,因此,提高全血中環孢素的最低檢測限尤為關鍵。文獻大多采用將全血標本提取后濃縮5～10倍,以提高進針樣品中環孢素的濃度的辦法,而儀器進樣量仍采用通常體積20μL［2～6］。本研究在實驗過程中也曾采用過此類方法,但結果仍不理想,主要是存在最低檢測限仍然不能滿足兒科臨床實際標本需要的缺點。受文獻［9］啟發,實驗過程中采用全血標本等體積提取(0.5→0.5 m L),200μL大體積進樣,結果發現可以克服上述不足,最低檢測限可達27 ng·mL-1,故確定進樣量為200μL。

3.2 全血中紅細胞膜處理 環孢素在血液中41%～58%分布在紅細胞中［1］,所以測定全血中環孢素的濃度時需要對全血樣品進行溶血預處理,一般采用氫氧化鈉、氟化鈉或十二烷基硫酸鈉破壞紅細胞,以保證有機溶劑對環孢素的萃取率［10］。尿素分子能夠自由進入到紅細胞內,利用滲透壓原理,本實驗采用10%尿素溶液加入到全血標本中以破壞紅細胞,高速離心后可見管底有一薄層膜狀物,吸取上清液上固相萃取柱,過柱速度基本令人滿意。

3.3 固相萃取小柱的選擇 實驗過程中分別嘗試用C8柱、C18柱、氨基柱、氰基柱、羧基柱等不同填料的固相萃取小柱,以甲醇或乙腈作為洗脫劑,結果均不滿意,內源性雜質較多,不能與環孢素達到有效分離。采用丙磺酸強陽離子型(PRS)固相萃取小柱,以“乙腈∶四氫呋喃=80∶20”作為洗脫劑,在環孢素色譜峰附近基本無內源性雜質干擾,故確定PRS小柱為環孢素全血標本處理固相萃取柱。

本研究建立的環孢素全血濃度測定方法,樣品處理簡單,準確度高,特異性好,用于兒科難治性腎病及再生障礙性貧血環孢素血藥濃度監測,結果令人滿意,值得推廣。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.009

Determination of Cyclosporin in Whole Blood by Solid-Phase Extraction and High Perform ance Liquid Chromatography

SONG Xin-wen,WANG Yang,LIU Xin,PENG Jing,XU Qiong
(Women and Children Health Care Center in Wuhan City,Wuhan 430016,China)

Objective To establish a simple high-performance liquid chromatography(HPLC)method to determinate cyclosporin in whole blood.MethodsThe HPLC was carried out by using Venusil ASB C18column,acetonitrile/water(70∶30)as a mobile phase,setting column temperature at 70℃,detection wavelength at 210 nm.Whole blood samples were centrifugated after treated with 10%urea for hemolysis.Two hundred microliters of the supernatantwas directly injected into the PRS-SPE column,using equal volume of acetonitrile/tetrahydrofuran(80∶20)as the eluent.ResultsThemethod is linear at 30 to 3 500 ng·mL-1curve range.The recoveries at low,medium and high concentrations(78.2,300.0,1 213.0 ng· mL-1)were 101.66%,104.06%and 100.46%,respectively.The intra-and inter-day RSD were less than 5%.ConclusionThemethod isaccurate,sensitive,and the sample iseasy to handle,fullymeeting the requirementof pediatric clinical practice for determination of cyclosporin in whole blood.

Cyclosporin;Solid phase extraction;Chromatography,high performance liquid

R979.5;R969

A

1004-0781(2014)01-0031-03

2013-03-18

2013-05-06

宋新文(1968-),男,湖北武漢人,副主任藥師,研究方向:治療藥物監測及兒科臨床藥學。電話：(0) 13797028603,E-mail：13797028603@126.com。