紫杉醇自微乳釋藥體系的處方工藝及穩定性研究*

周麗娟,陳曦,劉清飛,王義明,羅國安

(1.鄭州大學附屬鄭州中心醫院轉化醫學中心實驗室,鄭州 450007;2.清華大學生命科學與醫學研究院,北京 100084)

·藥物制劑與藥品質量控制·

紫杉醇自微乳釋藥體系的處方工藝及穩定性研究*

周麗娟1,2,陳曦2,劉清飛2,王義明2,羅國安2

(1.鄭州大學附屬鄭州中心醫院轉化醫學中心實驗室,鄭州 450007;2.清華大學生命科學與醫學研究院,北京 100084)

目的 優選紫杉醇自微乳的處方工藝,并研究其穩定性。方法以性狀、粒徑、含量、有關物質、細菌內毒素等為測定指標,考查不同pH和不同活性炭用量對工藝的影響,篩選出優化處方,并對其進行穩定性研究。結果制備的紫杉醇自微乳為淡黃色澄明液體,平均粒徑19.6 nm,呈Gauss分布。紫杉醇自微乳釋藥體系(PTX-SMEDDS)經高速離心后穩定,影響因素實驗結果表明,PTX-SMEDDS對高溫和光不穩定。6個月的加速實驗表明,各項指標均無明顯變化。確定紫杉醇自微乳應密封、低溫避光保存。結論紫杉醇自微乳制備工藝簡便,制劑穩定,載藥量高,適宜開發為注射自微乳釋藥體系。

紫杉醇;自微乳釋藥體系;制備;穩定性

紫杉醇(paclitaxel,PTX)是一種新型的微管穩定劑,臨床上用于卵巢癌和乳腺癌及非小細胞肺癌的一線和二線治療[1]。紫杉醇由于水溶性極差(約0.001 g·L-1),且口服藥物不吸收,已上市的紫杉醇注射液是以50%聚氧乙烯蓖麻油作為增溶劑,臨床應用中伴有嚴重的變態反應、血液毒性、神經毒性和低血壓,還可導致PVC包裝中增塑劑的溶出,毒性增加,且制劑稀釋后易析出結晶,在臨床應用受到了限制[2]。自微乳釋藥系統(self-microemulsifying drug delivery system,SMEDDS)是在微乳研究的基礎上發展起來的,由藥物、油相(oil)、表面活性劑(surfactant,SA)和助表面活性劑(cosurfactant,CoSA)組成的熱力學穩定、均一、透明的溶液。可作為疏水性、難吸收、易水解藥物的載體,具有能夠提高難溶性藥物的溶解度,提高生物利用度,減少注射引起的疼痛等特點,是難溶性藥物的理想注射用載體[3-4]。筆者在本研究中制備了紫杉醇自微乳釋藥體系(paclitaxel self-microemulsifying drug delivery system,PTX-SMEDDS),進行了處方工藝的研究,并對其穩定性進行評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);激光粒度散射儀(Nano ZS90型,英國Malvern公司);冷凍蝕刻儀(BALZERS BAF-400D型,列支敦士登公國Balzers公司);電子分析天平(XS105型,瑞士梅特勒-托利多公司);渦旋混合器(VDRTEX-5型,江蘇海門其林貝爾儀器公司);磁力攪拌器(EMS-8A型,天津市歐諾儀表公司);恒溫恒濕箱(SPX-250,上海特訊實業有限公司醫療設備廠)。

1.2 試藥 PTX原料(重慶美聯藥業有限公司,批號:091211,純度:99.53%);PTX-SMEDDS(自制,批號110806,110808,110810,規格:5 mL∶30 mg);PTX對照品(批號:101310-200906)、炔諾酮對照品(norethindrone,NTD,批號:100053-200705)均為中國食品藥品檢定研究院提供;聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyethylenated castor oil,EL35,德國BASF公司);卵磷脂(S-100)、中碳鏈甘油酯(medium chain triglycerid,MCT)均為德國Lipoid公司產品;維生素E (VitE,廣州白云山制藥總廠);脫氧膽酸鈉(DOC-Na,美國Sigma公司);甲醇、乙腈(色譜純,德國Merck公司);其余試劑均為分析純,水為注射用水。

2 方法與結果

2.1 PTX-SMEDDS含量測定 參照《新藥轉正質量標準》第25冊中紫杉醇注射液的質量標準含量測定方法進行實驗。

2.1.1 色譜條件 GraceSmart RP C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動相:甲醇-乙腈-水(30∶30∶40);流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:227 nm;柱溫:30℃;進樣量10 μL。

2.1.2 方法學實驗 PTX空白自微乳不干擾PTX的測定(圖1);在該實驗條件下,PTX的最低檢出量為0.6 ng(S/N≥3),PTX與NTD的保留時間分別為9.015,7.783 min,理論板數分別為17 576,13 259,分離度為4.93。標準曲線方程為F=0.060 1C+0.010 4 (r=0.999 9,n=7)。測定日內8 h和日間3 d的精密度,RSD分別為0.36%(n=6)和0.58%(n=6);平均回收率99.61%,RSD=0.82%(n=9)。結果說明該方法測定PTX-SMEDDS中PTX的含量可行。

2.2 有關物質測定 參照紫杉醇注射液的質量標準。采用HPLC法檢查本品的有關物質。

2.2.1 色譜條件 Agilent1100色譜儀(DAD檢測器),Agilent TC18(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測波長227 nm,流速1.5 mL·min-1,以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫。初始流動相為乙腈-水(40∶60),洗脫至主峰出完(約35 min),然后以每分鐘1.6%的速度增加乙腈的比例,25 min后,乙腈比例增至80%,再以每分鐘4%的速度降低乙腈的比例,10 min后,乙腈比例降至40%,保持此比例10 min。

2.2.2 方法學實驗 PTX空白自微乳不干擾測定;理論板數N按PTX峰計算為15 044,PTX和前后雜質峰的分離度分別為19.34和10.59(圖2)。對PTXSMEDDS進行酸破壞實驗、堿破壞實驗、高溫破壞實驗、氧化破壞實驗、光破壞實驗后溶液,分別調節成中性后,加流動相制成測定液,依法進樣測定,結果雜質峰和PTX能良好分離。

2.3 粒徑測定 參照《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄ⅪⅩE的要求,采用激光粒度散射儀測定[5]。

2.4 無菌檢查 取本品,各取1 mL,分別加滅菌水制成每毫升中含1 mg的溶液,依法檢查(《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄ⅪH),應符合規定。

2.5 細菌內毒素檢查 取本品,以細菌內毒素檢查用水稀釋40倍后,依法檢查(《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄ⅥE),本品每毫升含細菌內毒素應小于2.4 EU。

A.空白自微乳;B.PTX對照品;C.PTX-SMEDDS;1.NTD;2.PTX圖1 PTX的HPLC圖A.blank SMEDDS;B.PTX reference substance;C.PTX-SMEDDS;1.NTD;2.PTXFig.1 HPLC chromatograms of PTX

A.PTX-SMEDDS 4.8 mg·L-1;B.PTX-SMEDDS 480 mg·L-1;1.PTX圖2 PTX有關物質測定的HPLC圖A.4.8 mg·L-1PTX-SMEDDS;B.480 mg·L-1PTX-SMEDDS;1.PTXFig.2 HPLC chromatograms for related substances of PTX

2.6 PTX-SMEDDS的制備和質量考察

2.6.1 PTX-SMEDDS的處方 PTX 60 mg,EL35 32%,S-100 8%,Doc-Na 0.6%,無水乙醇48%,MCT 7.5%,VitE0.5%。

2.6.2 PTX-SMEDDS的制備工藝 氮氣流下,取處方量的S-100和無水乙醇置適當容器中,攪拌使S-100溶解,加入EL35、VitE、MCT、Doc-Na混勻后,加入處方量的PTX,攪拌使溶解。加入適量的無水檸檬酸,調節pH至4.0,加入0.25%注射用活性炭,35℃保溫30 min,經孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾脫炭,無菌灌封入安瓿瓶中,即得。按制備工藝制備3批PTXSMEDDS,批號為110806,110808,110810。

2.6.3 活性炭用量的選擇 氮氣流下,按“2.6.2”項下的配制方法,加入適量的無水檸檬酸,調節pH至4.0,分成5份,分別加入0%,0.05%,0.15%,0.25%, 0.40%(W/V)的活性炭,35℃保溫30 min,過濾脫炭后,無菌分裝即得。分別考察在不同活性炭用量下性狀、含量、有關物質、熱原的變化。結果在不同的活性炭用量的條件下,PTX-SMEDDS均呈淡黃色透明液體。只有加入0.40%活性炭用量,與脫炭前相比,含量有所下降,其余含量均變化不大。有關物質均無明顯變化。當活性炭的用量達到0.15%以上時,細菌內毒素才符合規定。因PTX對高溫不穩定,綜合以上因素考慮:定脫炭工藝為0.25%活性炭、35℃保溫30 min即可。

2.6.4 pH的選擇 氮氣流下,按“2.6.2”項下的配制方法,分成5份,加入無水檸檬酸,分別調節pH為3.0, 3.5,4.0,4.5,5.0,各加入0.25%注射用活性炭,35℃保溫30 min,過濾脫炭后,無菌封裝即得。分別考察在不同pH下性狀、含量、有關物質、0.9%氯化鈉注射液和5%葡萄糖注射液稀釋10倍后粒徑的變化。結果在不同的pH條件下,PTX-SMEDDS均呈淡黃色澄明液體。在可允許使用的pH范圍內,粒徑、有關物質、含量均未發生較大變化。說明pH在3～5的范圍內對微乳無影響。結合PTX注射液質量標準中規定的pH和PTX在酸性條件下較穩定[6],將PTX-SMEDDS的pH定為3.0～5.0。

2.6.5 穩定性實驗

2.6.5.1 離心穩定性 將PTX-SMEDDS用0.9%的氯化鈉注射液和5%的葡萄糖注射液分別稀釋10倍和20倍后,輕搖形成微乳,觀察沉淀和分層,并將稀釋后的微乳置于具塞試管中,3 000 r·min-1離心30 min[7]。結果稀釋形成微乳后12 h內未見有沉淀產生和分層現象,且經30 min離心實驗,微乳仍為澄明且略帶乳光的淡黃色溶液,不分層。該自微乳形成微乳的穩定性良好。

2.6.5.2 配伍實驗 將批號為110806的PTX-SMEDDS用0.9%的氯化鈉注射液和5%的葡萄糖注射液分別稀釋10倍和50倍后,結果配伍12 h內微乳澄清透明,無沉淀析出。將放置12 h的稀釋液用微孔濾膜過濾后,測定pH、粒徑、含量[8]。結果與配伍0 h相比,各項指標均無明顯變化。說明PTX-SMEDDS與0.9%的氯化鈉注射液和5%的葡萄糖注射液配伍12 h穩定性良好。

2.6.5.3 影響因素實驗 取PTX-SMEDDS(110806),置于60,40,4℃、光照(4 000～5 000 Lx)條件下放置10 d,分別于0,5,10 d末取樣測定及凍融實驗(將樣品置于-4℃2 d,再放置于40℃2 d,即凍融1次,連續循環3次),取樣考察外觀、pH、含量、粒徑、有關物質[8]。結果:PTX-SMEDDS經強光照射后,溶液顏色變淺;60℃實驗條件下有關物質從0.43%增加到1.40%,其他條件各項指標均無明顯變化。表明PTXSMEDDS受溫度影響較大,高溫貯藏不穩定,應低溫避光放置。結果見表1。

2.6.5.4 加速實驗 取PTX-SMEDDS(批號:110806, 110808,110810)于(40±2)℃恒溫箱中放置6個月進行加速實驗,分別于0,1,2,3,6個月時取樣考察外觀、pH、含量、粒徑、有關物質等,各項指標與0 d時數據比較,外觀均為淡黃色澄明液體,各項指標均無明顯變化。見表2。于6個月末進行細菌內毒素和無菌檢查,結果符合規定。

3 討論

本品的含量測定方法參照PTX注射液質量標準中的色譜條件進行了流動相比例的調節,經方法學實驗確定流動相為甲醇-乙腈-水(30∶30∶40),節省分析時間,回收率高,精密度和重現性好。且PTXSMEDDS采用甲醇稀釋制成測定液,操作簡便,便于樣品的分析。

PTX在水中的溶解度約0.001 g·L-1,將其制成PTX-SMEDDS后,載藥量可達到為6 g·L-1,是目前PTX的有關文獻報道[9-10]中載藥量最大的自微乳,且經有關實驗表明,PTX-SMEDDS經氯化鈉注射液和葡萄糖注射液稀釋后的相比市售PTX注射液更不易導致PTX的析出。

表1 PTX-SMEDDS影響因素實驗結果Tab.1 Results of stress testing on PTX-SMEDDS ±s,n=3

表1 PTX-SMEDDS影響因素實驗結果Tab.1 Results of stress testing on PTX-SMEDDS ±s,n=3

實驗條件時間/dpH含量/(g·L-1)粒徑/nm有關物質/% 40℃03.91±0.026.07±0.0119.6±0.30.43±0.01 5 3.88±0.016.06±0.0019.1±0.40.45±0.02 103.87±0.016.08±0.0118.9±0.30.44±0.02 60℃53.90±0.026.06±0.0119.3±0.40.71±0.03 103.91±0.016.05±0.0020.1±0.21.40±0.02 4℃53.91±0.016.09±0.0119.9±0.40.40±0.01 103.90±0.026.07±0.0019.3±0.30.44±0.02光照53.90±0.016.08±0.0118.6±0.20.47±0.03 103.89±0.026.07±0.0120.3±0.40.42±0.02凍融實驗1次3.89±0.016.08±0.0019.5±0.10.48±0.01 2次3.90±0.016.07±0.0119.6±0.20.45±0.03 3次3.92±0.026.09±0.0119.2±0.30.46±0.02

表2 PTX-SMEDDS加速實驗結果Tab.2 Results of accelerated test on PTX-SMEDDS ±s,n=3

表2 PTX-SMEDDS加速實驗結果Tab.2 Results of accelerated test on PTX-SMEDDS ±s,n=3

批號時間/個月pH含量/(g·L-1)粒徑/nm有關物質/% 11080603.91±0.026.07±0.0119.6±0.30.43±0.01 1 3.93±0.016.04±0.0119.8±0.40.42±0.02 2 3.89±0.026.06±0.0119.0±0.30.44±0.03 3 3.87±0.016.09±0.0218.6±0.30.46±0.02 6 3.90±0.026.05±0.0118.5±0.40.47±0.01 11080804.10±0.015.98±0.0120.1±0.40.49±0.01 1 4.06±0.016.01±0.0018.9±0.30.46±0.02 2 4.08±0.026.02±0.0119.3±0.40.50±0.02 3 4.05±0.015.99±0.0019.7±0.30.46±0.03 6 4.06±0.015.97±0.0119.4±0.10.48±0.01 11081004.23±0.016.16±0.0019.3±0.30.43±0.03 1 4.20±0.026.17±0.0118.2±0.30.47±0.01 2 4.25±0.016.15±0.0118.9±0.20.46±0.02 3 4.19±0.016.13±0.0018.7±0.10.43±0.01 6 4.22±0.016.15±0.0119.6±0.40.44±0.03

PTX-SMEDDS經長期實驗放置后,十分穩定,性狀、pH、含量、有關物質等均無明顯變化。本研究中EL35用量比市售PTX注射液減少了36%。預實驗考察了PTX-SMEDDS在體外的溶血性、豚鼠急性過敏性和小鼠尾靜脈注射急性毒性,結果發現PTX-SMEDDS體外溶血性、變態反應的發生率和死亡率均低于市售注射液。PTX-SMEDDS小鼠尾靜脈注射的LD50為市售注射液的1.9倍,毒性降低。下一步實驗中安全性評價將會做深入的研究。但PTX-SMEDDS被注射進入體內,經血漿及體內環境無限稀釋后是否穩定,在體內能否起到腫瘤靶向作用,需進一步深入研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.023

Formulation and Stability Studies on Paclitaxel Self-microemulsifying Drug Delivery System

ZHOU Li-juan1,2,CHEN Xi2,LIU Qing-fei2,WANG Yi-ming2,LUO Guo-an2(1.Central Laboratory of Translational Medicine,Affiliated Zhengzhou Central Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450007, China;2.Institute of Biomedicine,Tsinghua University,Beijing 100084,China)

Objective To study the preparation and stability of paclitaxel self-microemulsifying drug delivery system (PTX-SMEDDS).MethodsThe formulation of the PTX-SMEDDS was optimized by monitoring the appearance,particle size, concentration,relative substance,and bacterial endotoxin.Influence of different pH and different dosage of activated carbon on PTX-SMEDDS was investigated.Subsequently it was subjected to stability studies.ResultsThe PTX-SMEDDS was a translucent diluted-yellow solution with a mean diameter of 19.6 nm.High speed centrifugal test indicated PTX-SMEDDS was stable.The result of the influential factor tests showed PTX-SMEDDS was unstable to high temperature and light.In the accelerated tests for 6 months,the quality of PTX-SMEDDS was stable.The samples should be sealed and stored at low temperature and shady place.ConclusionEasily prepared and stable formulation of PTX-SMEDDS is achieved,and further investigation is warranted to develop self-microemulsifying drug delivery system for injection.

Paclitaxel;Self-microemulsifying drug delivery system;Preparation;Stability

R979.1;TQ460.6

A

1004-0781(2014)08-1063-05

2013-10-09

2014-01-29

*國家自然科學基金資助項目(30500666);清華大學-裕元基金資助項目(20240000548)

周麗娟(1979-),女,河南鄭州人,主管藥師,碩士,從事藥物新技術研究。電話:0371-67690264,E-mail: zhou750423@126.com。

羅國安(1946-),男,北京人,教授,博士生導師,從事中藥方劑化學和現代中藥質量控制體系、新型給藥系統研究。電話:010-62781688,E-mail:luoga@chem.tsinghua. edu.cn。