艾迪注射液對小鼠放射性肺損傷的防治作用

黎建緒，鄭雅梅，胡曉燕，滕凱，曹如波，劉莉

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院腫瘤中心，武漢 430023)

艾迪注射液對小鼠放射性肺損傷的防治作用

黎建緒，鄭雅梅，胡曉燕，滕凱，曹如波，劉莉

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院腫瘤中心，武漢 430023)

目的觀察艾迪注射液在放射性肺損傷中的防治作用,并探討其相關機制。方法將SPF級C57BL/6小鼠120只隨機分為4組:空白對照組,照射+艾迪組,照射+甲潑尼龍組和照射組,每組30只。給予小鼠單次12 Gy胸部照射以建立放射性肺損傷模型,照射前2 h及以后每日腹腔注射艾迪及甲潑尼龍。分別于照射后1,24,72 h及1,2,4,8, 16和24周處死小鼠,取左肺固定做組織切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察病理變化、Masson染色觀察膠原形成和免疫組化檢測轉化生長因子β1(TGF-β1)蛋白含量,取右肺行Western-blot測定TGF-β1蛋白含量,Real-time聚合酶鏈反應(PCR)測定TGF-β1mRNA含量。結果小鼠在接受照射后于1～2周出現放射性肺炎表現,TGF-β1mRNA和蛋白含量升高,但在給予艾迪注射液和甲潑尼龍處理組中TGF-β1mRNA和蛋白相對含量較照射組少,差異有統計學意義(P<0.05),照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組差異無統計學意義。在照射后16及24周觀察到纖維形成增加,但照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組較照射組少。結論艾迪注射液和甲潑尼龍可以下調因照射引起的TGF-β1mRNA和蛋白含量上升,二者在此作用上未觀察到差別,這可能是其減輕放射性肺損傷的關鍵。

艾迪注射液；損傷,肺,放射性；轉化生長因子β1

放射治療(放療)是胸部惡性腫瘤治療的主要方法之一,但由于在放療過程中部分肺組織不可避免地受到照射,且肺是放射敏感器官,因此由放療引起放射性肺損傷成為胸部腫瘤治療的一個常見并發癥,這不但影響放療劑量進而影響腫瘤治療效果,還降低患者生活質量甚至危及生命。放射性肺損傷分為放射性肺炎(放療后1～3個月)和放射性肺纖維化(放療后數月至數年)。國內外許多研究證明抑制轉化生長因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的生成可以緩解放射性肺損傷癥狀并改善的程度。臨床上放射性肺炎的治療藥物仍然主要是大劑量糖皮質激素,但其易致腫瘤復發,不良反應多,而放射性肺纖維化至今仍無特效藥物［1-2］。近年來,中藥在防治放射性肺損傷中的作用越來越受到關注。臨床研究表明一些具有清熱解毒、養陰益氣、活血化瘀功效的中藥具有不同程度的預防和治療放射性肺損傷的作用［3］。筆者觀察了艾迪注射液對小鼠放射性肺損傷的預防和治療作用,對其可能的作用機制進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級8周齡C57BL/6雌鼠120只,體質量(20±2)g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,飼養于SPF級小鼠飼養室。

1.2 試藥 艾迪注射液(貴州益佰制藥股份有限公司,批號:20111020),其組方為斑蝥、人參、黃芪、刺五加。艾迪注射液10 mL加0.9%氯化鈉溶液稀釋20 mL配成工作液,腹腔注射0.15 mL·(10 g)-1(生藥3.75 g·kg-1)；甲潑尼龍［甲潑尼龍琥珀酸鈉,法瑪西亞普強(中國)有限公司產品,批號:20111123］,甲潑尼龍40 mg加0.9%氯化鈉溶液至64.5 mL配成工作液,腹腔注射0.15 mL·(10 g)-1(9.3 mg·kg-1)。兔抗小鼠TGF-β1一抗(BioVision,CA 94043 USA),山羊抗兔二抗(Proteintech Group),ReverTra Ace-α-(Code No:FSK-100,toyobo),SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa,Code:DRR420A),

1.3 儀器 免疫組化試劑盒(中杉金橋,SP9001), TRIzol Reagent(Invitrogen,15596026),ABI StepOnePlusTM,六一電泳儀(北京,DYCZ-24DN), OLYMPUS TH4-200。

1.4 動物分組與造模 小鼠隨機分為4組(空白對照組,照射+艾迪組,照射+甲潑尼龍組和照射組),照射前小鼠腹腔注射10%水合氯醛0.06 mL麻醉,麻醉后采用自治固定裝置固定,仰臥于治療床。SSD＝100 cm,射野40 cm×3 cm,d＝3 cm,雙肺中平面單次照射12 Gy,建立小鼠放射性肺損傷模型［4］。照射前2 h和照射后每日同一時間予艾迪注射液或甲潑尼龍腹腔注射,于照射后1,24,72 h及1,2,4,8,16和24周各組分別隨機取3只小鼠處死,左肺用4%多聚甲醛固定2 d后包埋,右肺分3塊后置-80℃保存以提蛋白做Western-blot或提RNA做逆轉錄及實時逆轉錄聚合酶鏈反應(real-time quantitative reverse transcripiase polymerase chain reaction,Real-time RT-PCR)。

1.5 組織病理檢查 常規蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色,光鏡下觀察病理組織結構。16和24周小鼠行Masson染色觀測膠原含量。

1.6 免疫組化 用包埋的組織做切片,在二甲苯中脫蠟和梯度乙醇溶液中再水化,放在枸櫞酸鹽中96℃1 h抗原修復,封閉15 min后加入兔抗小鼠TGF-β1一抗(稀釋比1∶20),4℃過夜,用過氧化氫(H2O2) 37℃20 min滅活內源性過氧化物酶,加入二抗37℃ 30 min后加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37℃30 min,在顯微鏡下控制二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)染色時間后蘇木精6 s染核,脫水并封片。免疫組化半定量評分法［5］,0分:無著色,與背景色一致,陽性細胞比例<5%,陰性(細胞內出現黃色顆粒為陽性)；1分:淺黃色,略高于背景色,陽性細胞率<10%；2分:棕黃色,明顯高于背景色,陽性細胞率為～50%；3分:棕褐色,陽性細胞率為～75%；4分:陽性細胞率為>75%。

1.7 Real-time RT-PCR 主要步驟:在研磨器中加入TRIzol并研磨組織后提總RNA,后按ToYoBo FSK-100說明進行逆轉錄,按SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)說明加試劑后行兩步法PCR反應,反應條件如下:預變性95℃30 s,擴增條件95℃5 s,60℃35 s,重復40個循環。引物序列如下:β-actin上游引物GCATTGCT-GACAGGATGCAG下游引物CCTGCTTGCTGATCCACATC,TGF-β1上游引物TGCGCTTGCAGAGATTAAAA,下游引物AGCCCTGTATTCCGTCTCCT。引物序列經Premier 5.0和Oligo7設計驗證。

1.8 Western-blot 在研磨器中加入RIPA蛋白裂解液研磨溶解組織后提取總蛋白,加樣后在濃縮膠和分離膠中電泳分離蛋白,在轉膜液中用0.45μm聚偏氟乙烯樹脂［poly(vinylidene fluoride),PVDF］膜150 mA轉膜100 min,5%牛奶封閉1 h后覆一抗4℃過夜,覆二抗1 h后行電致化學發光(electrochemiluminescence,ECL)顯色反應。結果用Gel-Pro analyzer軟件讀出內參、目的積分灰度值(IA),相對含量即為目的積分灰度值/內參積分灰度值。

1.9 統計學方法 所有數據均使用SPSS18.0版軟件進行分析,運用單向方差分析(ANOVA)方法進行統計,當P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織病理學改變 HE染色在空白對照組未觀察到肺泡炎改變,無明顯炎性細胞浸潤,肺泡間隔未見增厚；而所有接受照射的小鼠從72 h到1周起出現肺泡壁水腫、充血,并有大量炎癥細胞浸潤,肺泡間隔增厚,照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組一般為0～1級肺泡炎表現,而照射組則一般表現為2～3級肺泡炎。Masson染色在空白對照組未觀察到明星膠原沉積,所有接受照射小鼠的膠原明顯增多,但照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組明顯較照射組少,而這兩組之間無明顯差別。見圖1,2。

2.2 免疫組化 空白對照組支氣管上皮呈不均一表達,肺實質少量肺泡巨噬細胞呈陽性表達,而血管內皮和肌層均呈陰性。所有接受照射的小鼠在照射后72 h和2,4,8,16和24周均可見大量肺泡巨噬細胞和Ⅱ型肺泡細胞呈陽性表達,還可見許多陽性纖維母細胞增生,以16周明顯。以免疫組化半定量評分法計算,照射后1,2,4,8,16和24周所有照射的小鼠TGF-β1含量明顯升高,在8和16周達到高峰,除1周外,照射組TGF-β1含量較照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組高,差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01),同時在72 h,照射組也較照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組高,差異有統計學意義。照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組TGF-β1含量在任一時間點均差異無統計學意義。見圖3,4。

2.3 Real-time RT-PCR 照射后1,2,4,8和16周時照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組肺組織TGF-β1mRNA的表達較照射組低,差異有統計學意義,照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組肺組織TGF-β1mRNA的表達在任一時間均差異無統計學意義,但仍高于空白對照組,所有受到照射小鼠的TGF-β1mRNA表達在照射后8周達到最高峰。見圖5。

圖1 4組小鼠1周時肺組織HE染色(×400)A.空白對照組;B.照射+艾迪組;C.照射+甲潑尼龍組;D.照射組Fig.1 HE staining on lung tissues of four groups ofmice after one weekA.black control group;B.Aidi injection plus radiation group;C.Solu Medrol plus radiation group;D.radiation group

圖2 4組小鼠24周時Masson染色(×400)A.空白對照組;B.照射+艾迪組;C.照射+甲潑尼龍組;D.照射組Fig.2 Masson staining on four groups of mice after 24 weeksA.black control group;B.Aidi injection plus radiation group;C.Solu Medrol plus radiation group;D.radiation group

圖3 4組小鼠8周時免疫組化圖A.空白對照組;B.照射+艾迪組;C.照射+甲潑尼龍組;D.照射組Fig.3 Immunohistochemical staining on four groups ofmice after eight weeksA.black control group;B.Aidi injection plus radiation group;C.Solu Medrol plus radiation group;D.radiation group

圖4 4組小鼠免疫組化半定量評分法計算得到的TGF-β1表達量

圖5 4組TGF-β1mRNA含量

2.4 Western-blot 照射組在照射后8和16周檢測到TGF-β1蛋白相對含量(目的IA/內參IA)較照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組高,差異有統計學意義。所有受到照射小鼠的TGF-β1蛋白相對含量均較空白對照組增高,差異有統計學意義,然而也觀察到照射+艾迪組在16周TGF-β1蛋白相對含量較照射+甲潑尼龍組減少,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 4組在8和16周用W estern blot檢測到TGF-β1表達量A.空白對照組;B.艾迪+照射組;C.甲潑尼龍+照射組;D.照射組Fig.6 TGF-β1protein expression in four groups of mice after 8 weeks and 16 weeksA.black control group;B.Aidi injection plus radiation group; C.Solu Medrol plus radiation group;D.radiation group

3 討論

放射性肺炎是由免疫介導的產生雙側淋巴細胞性肺泡炎和局部放射反應,其病理學基礎是射線直接作用于DNA,導致基因和大分子化合物的損傷以及脂質過氧化作用的間接啟動凋亡途徑和炎癥的級聯效應［6-7］。放射性肺纖維化則是在急性放射性肺炎發生的遷延,由損傷的靶細胞(主要是肺泡上皮細胞、血管內皮細胞、巨噬細胞和成纖維細胞等肺內效應細胞)釋放多種細胞因子,尤其是促纖維細胞生長因子,如TGF-β1、PDGF、FGF等,啟動成纖維細胞的增殖分裂,促進膠原蛋白的大量合成,最終形成膠原沉積［8-9］。許多研究表明肺部受照射后,多種細胞因子合成增加,特別是白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、TGF-β1和腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factorα,TNF-α)［10］。進一步研究顯示, TGF-β1是誘發放射性肺纖維化的關鍵因素,具有強促纖化作用,它主要作用于膠原的轉錄和翻譯過程,加速肺纖維化的發生,并能趨化炎性細胞及單核巨噬細胞,誘導其合成釋放PDGF、TNF、IL-1、IL-6等細胞因子,擴大生物效應［11］。綜上所述,細胞因子尤其是TGF-β1的致炎及纖維化作用及其產生的級聯放大效應是導致放射性肺損傷和纖維化的重要機制。研究也表明,通過有效的干預策略,放射性肺損傷的病程或病理學改變可被有效逆轉,而阻斷TGF-β1的信號轉導通路或降低TGF-β1的表達無疑是應高度關注的靶點［12］。

目前臨床上主要治療放射性肺炎的藥物仍是大劑量糖皮質激素,但由于糖皮質激素長期使用易致腫瘤復發、多種不良反應產生,而放射性肺纖維化至今仍無特效藥物。故亟需尋找能防治放射性肺損傷且不良反應少的藥物。多數中藥以不良反應輕著稱,可能在防治放射性肺損傷上有一定優勢傳統醫學大多數學者認為放射線是一種熱毒燥邪,放射性肺纖維化乃因熱毒內侵、灼傷肺絡、傷津耗氣,進而導致血絡瘀阻。治療上主要有清熱解毒、益氣養陰和活血化瘀3種方法［13-15］。本實驗組成員也重點研究中藥在放射性肺損傷中的作用,研究表明參芪扶正液具有下調TGF-β1和TNF-α的作用從而發揮防治放射性肺損傷作用［16-17］。艾迪注射液中的黃芪、人參具有不同程度的抗氧化和清除自由基的作用,從而減少射線造成的過氧化損傷,減輕放射性肺損傷；斑蝥有攻毒蝕瘡,破血散結的作用能改善血液循環作用,而起到抑制膠原纖維合成及抗纖維化作用,此外其還可通過影響與放射性肺炎有關細胞因子的表達而發揮作用［18］。

在本實驗結果中,艾迪注射液與甲潑尼龍顯示出減輕放射性肺損傷的作用。照射組小鼠的肺HE染色顯示放射性肺炎程度較空白對照組、照射+艾迪組和照射+甲潑尼龍組明顯嚴重；照射組小鼠膠原形成較其他3組明顯增多；在多個時間點時照射組小鼠TGF-β1蛋白及mRNA水平較其他3組增多。在16周Westernblot測定提示可能艾迪在防治放射性纖維化較甲潑尼龍的作用更強。艾迪注射液防治放射性肺損傷的作用機制可能為通過影響細胞因子表達,從而抑制關鍵因子TGF-β1的轉錄和翻譯,使其表達量減少。其相關機制尚需進一步研究。

總之,本研究表明艾迪注射液可以在一定程度上防治小鼠放射性肺損傷,其作用與甲潑尼龍相似。

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DOI 10.3870/yydb.2014.02.013

Preventive and Therapeutic Effect of Aidi Injection on Radiation-Induced Lung Injury

LI Jian-xu,ZHENG Ya-mei,HU Xiao-yan,TENG Kai,CAO Ru-bo,LIU Li
(Cancer Center,Union Hospital, Tongji Medical College,Huazhong University ofScience and Technology,Wuhan 430023,China)

Objective To study the effect ofaidiinjection on radiation-induced lung injury and the probable Mechanism.MethodsOne hundred and twenty C57BL/6 mice were exposed to either shamradiation or single fraction of 12 Gy delivered to the thorax.Four groupswere defined as follows:in normal controlgroup,themice received neither radiation nor drug;inaidiinjection+radiation group,the mice received radiation andaidiinjection;in Solu Medrol+radiation group,the mice received Solu Medrol;in radiation group,themice were exposed to radiation.Aidi or Solu Medrolwere injected intraperitoneally 2 h before the radiation and daily after the radiation.Mice were sacrificed 1,24,72 hours,1,2,4,8,16 and 24 weeks after radiation.The left lungs were fixed and sectioned.The sections were stained by haematoxylin and eosin,masson stain and immunohistochemical stain for transforming growth factorβ1(TGF-β1).The right lungs were collected to detect TGF-β1mRNA expression by real-time quantitative reverse transcipiase polymerase chain reaction(RT-PCR)and TGF-β1protein expression by Western blotting.ResultsPneumonitis developed 1 to 2 weeks after radiation.Their TGF-β1mRNA and protein expression levels in radiation-treated mice were significantly higher than those in normal control group(bothP<0.05).But the effectswere reversed byaidiand Solu Medrol treatment(P<0.05).The TGF-β1mRNA and protein expression levels were not significantly different betweenaidiand Solu Medrol treatment.ConclusionBothaidiinjection and Solu Medrol can significantly downregulate TGF-β1mRNA and protein expression levels in the lungs of mice with radiation-induced lung injury.There is no significant difference in the effect betweenaidiinjection and Solu Medrol.

Aidiinjection;Injury,radiation,lung;Transforming growth factor-1

R286;R965

A

1004-0781(2014)02-0184-05

2013-01-14

2013-04-03

黎建緒(1986-),男,廣西梧州人,碩士,研究方向:惡性腫瘤早期診斷。電話:(0)15871492176,E-mail：lijianxu1236@163.com。

劉莉,女,教授,主任醫師,博士生導師,博士,從事腫瘤診治工作。電話:(0)13720378323,E-mail：liulixiehe2004@163.com。