不同樣品溶劑對高效液相色譜-蒸發光散射檢測器測定黃芪甲苷的影響*

徐靜,劉天強,彭衡陽,肖丹,2

(1.通威股份有限公司,成都 610041;2.成都中醫藥大學,成都 611137)

·藥物制劑與藥品質量控制·

不同樣品溶劑對高效液相色譜-蒸發光散射檢測器測定黃芪甲苷的影響*

徐靜1,劉天強1,彭衡陽1,肖丹1,2

(1.通威股份有限公司,成都 610041;2.成都中醫藥大學,成都 611137)

目的 考察不同樣品溶劑對高效液相色譜-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)測定黃芪甲苷的影響。方法以黃芪和感毒清顆粒為樣品,以甲醇、90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇、32%乙腈、15%乙腈和水為樣品溶劑,采用HPLC-ELSD測定黃芪甲苷的含量。結果以90%甲醇溶液為樣品溶劑,其系統適用性良好,準確度、精密度、線性關系等方法學驗證指標符合要求。結論采用90%甲醇溶液作為樣品溶劑,更有利于黃芪及制劑中黃芪甲苷的質量控制。

黃芪甲苷;樣品溶劑;溶劑效應;色譜,高效液相;檢測器,蒸發光散射

在反相高效液相色譜中,當溶解樣品的溶劑(以下簡稱“樣品溶劑”)較流動相的洗脫強度強時,可能產生峰變形、峰面積變化、柱效降低等溶劑效應[1-2];解決方法有以流動相或相近的溶劑溶解樣品、減小進樣體積、以強溶劑(即溶劑洗脫能力比流動性強)溶解樣品后用等體積流動相稀釋后進樣或以弱溶劑溶解樣品后加大進樣量等能夠降低樣品溶劑強度來消除;已報道的品種有阿魏酸、黃芩苷、青藤堿、格列奈的左旋異構體、鹽酸小檗堿片和鹽酸環丙沙星片等[3-5]。筆者在開展抗沙門氏菌的中草藥體外篩選試驗研究中,為保證藥材質量,對待篩藥材黃芪的有效成分——黃芪甲苷進行含量測定時,參照《中華人民共和國藥典》2010年版方法,均以甲醇為樣品溶解的溶劑[6-7],多次出現同一份樣品連續進樣的峰面積差異大、拖尾嚴重,偶有裂峰、雙頭峰等現象。在排查環境條件(實驗室溫濕度),高效液相系統(流動相配比、流速、色譜柱、柱溫)和檢測器(霧化溫度、氣流速度)等因素后,認為溶劑效應是致此現象的重要因素。筆者結合系統適用性實驗,以峰面積變化為主要考察指標,考察并篩選了能降低溶劑強度的樣品溶劑,最后進行方法學驗證,旨在為黃芪及其制劑提供更優的色譜條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津公司),2000ES檢測器(美國Alltech公司),BP211D電子天平[d=0.01 mg(80 g),d=0.1 mg(210 mg),德國賽多利斯公司],KQ5200E型超聲波清洗器(工作頻率:40 kHz,昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 黃芪甲苷(中國食品藥品檢定研究院,批號:110727-200613),黃芪(成都國際商貿城荷花池中藥材專業市場,產地為內蒙古,符合《中華人民共和國藥典》2010版一部黃芪項下有關規定),感毒清顆粒(四川禾正制藥有限責任公司,中試樣品,批號: 120314,120315,120316),乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 精密稱取過篩孔內徑(250 ±9.9)μm篩的黃芪藥材粉末4 g,置索氏提取器中,加甲醇40 mL,冷浸過夜,加熱回流4 h,提取液蒸干,殘渣加水10 mL,微熱使溶解,用水飽和的正丁醇振搖提取4次,每次40 mL,合并正丁醇液,用氨試液充分洗滌2次,每次40 mL,棄去氨液,正丁醇液蒸干,殘渣加水5 mL使溶解,放冷。通過D101型大孔吸附樹脂柱(內徑為1.5 cm,柱高為12 cm),以水50 mL洗脫,棄去水液,再用40%乙醇30 mL洗脫,棄去洗脫液,繼用70%乙醇80 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘渣加待考察的樣品溶劑定容至5 mL,過孔徑0.45μm微孔濾膜,即得供試品A溶液。取感毒清顆粒(批號: 120314)和缺黃芪陰性顆粒,研細,分別精密稱取4和3 g,置索氏提取器中,同法制成供試品B溶液和陰性樣品溶液[7]。

2.2 色譜條件 色譜柱:Welch UltimateTMC18(4.6 mm×250 mm,5μm);流動相:乙腈-水(32∶68);流速:1 mL·min-1;柱溫:25℃;蒸發光檢測器的檢測參數:漂移管溫度100℃,氣體流速2.8 L·min-1,撞擊器狀態為關,信號放大倍數為1。

2.3 考察不同樣品溶劑對測定黃芪甲苷的影響 將“2.1”項下“待考察的樣品溶劑”分別擬定為“甲醇、90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇、32%乙腈、15%乙腈和水”制成供試品溶液,并分別配制黃芪甲苷對照品溶液(約0.5 mg·mL-1)。其中樣品在甲醇、90%甲醇中完全溶解,在80%甲醇、70%甲醇、水中出現輕微糊化現象,在32%乙腈、15%乙腈中出現明顯糊化現象。照“2.2”項下的色譜條件,取對照品、供試品A、B和陰性溶液依次進樣10μL,各連續進樣5次(對照品進樣5次是系統適用性實驗的要求,樣品進樣5次是為了考察峰面積的變化情況),記錄色譜圖和峰面積。在各種擬定的樣品溶劑下,黃芪甲苷對應峰的位置,供試品與對照品保留時間基本一致、陰性無干擾,分離度、理論板數等指標良好,對應的峰面積見表1。

表1 不同樣品溶劑對黃芪甲苷峰面積的影響Tab.1 Effect of different solvents on peak area of AstragaliⅣ

由表1可知,以甲醇為樣品溶劑,對樣品溶解性能良好,但其溶劑強度強于流動相,溶劑效應比較明顯,表現為峰面積不穩定;隨著甲醇濃度的降低,溶劑效應開始減弱,但對樣品的溶解性能也逐漸減弱,峰面積較甲醇為樣品溶劑的峰面積明顯偏小,可能是樣品溶解不充分,黃芪甲苷有部分包裹所致。另外,以不同比例的乙腈-水(流動相或比流動相中有機相溶度更低的溶劑)作為樣品溶劑也可減弱溶劑效應,但對樣品的溶解性能極差,峰面積也偏小。綜合溶解性能和降低溶劑效應等方面考慮,以90%甲醇作為樣品溶劑更有優勢。

2.4 方法學驗證 以感毒清顆粒和缺黃芪陰性顆粒劑樣品,照“2.1”項下“待考察的樣品溶劑”確定為“90%甲醇”,分別制備供試品和陰性樣品溶液,并以90%甲醇配制黃芪甲苷對照品溶液(0.508 mg·mL-1),進行方法學考察。

2.4.1 專屬性實驗 照“2.2”項下的色譜條件,取對照品、供試品和陰性樣品溶液各10μL進樣,記錄色譜圖,結果顯示陰性無干擾。見圖1。

A.陰性樣品;B.黃芪甲苷對照品;C.供試品;1.黃芪甲苷圖1 感毒清顆粒專屬性色譜圖A.negative sample;B.standard substance of astragaliⅣ;C. sample;1.astragaliⅣFig.1 Specificity chromatography for ganduqing granuless

2.4.2 線性關系考察 分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液5,10,15,20,25μL注入液相色譜儀,以黃芪甲苷濃度進樣量為橫坐標(X),峰面積值的自然對數為縱坐標(Y),進行回歸分析,Y=1.672 8X+12.164,R2= 0.999 6。表明黃芪甲苷2.54～12.70μg呈良好的線性關系。

2.4.3 精密度實驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10μL,連續測定6次,結果峰面積RSD=1.14%。

2.4.4 樣品溶液的穩定性實驗 取同一供試品溶液(批號:20120314)10μL,分別于0,2,4,8,16 h測定,以外標兩點法計算,結果黃芪甲苷含量值RSD= 1.23%,表明供試品溶液在16 h內基本穩定。

2.4.5 重復性實驗 稱取樣品6份(批號: 20120314),照“2.1”項下“待考察的樣品溶劑”確定為“90%甲醇”制成供試品溶液,精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10和20μL、供試品溶液10μL,測定,以外標兩點法計算,黃芪甲苷含量平均值為0.914 9 mg·g-1, RSD=1.41%,表明本法重復性良好。

2.4.6 準確度實驗 采用加樣回收實驗:取已知準確含量的樣品(批號:20120314)6份,每份約2 g,精密稱定,分別加入黃芪甲苷對照品(2.02 mg·mL-1)1 mL,照“2.1”項下“待考察的樣品溶劑”確定為“90%甲醇”制成供試品溶液,精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10和20μL、供試品溶液10μL,測定,以外標兩點法計算黃芪甲苷含量,結果顯示平均回收率為100.04%,RSD= 2.83%。見表2。

表2 加樣回收率實驗結果Tab.2 Results of recovery test

2.4.7 樣品含量測定 分別取3批(批號:120314, 120315,120316)感毒清顆粒,照“2.1”項下“待考察的樣品溶劑”確定為“90%甲醇”制成供試品溶液,精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10和20μL、供試品溶液10μL,測定,以外標兩點法計算黃芪甲苷含量。結果黃芪甲苷含量依次為0.92,0.94,0.91 mg·g-1,平均含量0.92 mg·g-1。

3 討論

本實驗是在采用《中華人民共和國藥典》2010年版一部測定黃芪及其制劑中黃芪甲苷含量過程中產生溶劑效應時所進行的探索性研究。筆者除嘗試了較原樣品溶劑(甲醇)強度更低的不同濃度的甲醇溶液和乙腈溶液外,曾嘗試先以甲醇、N,N-二甲甲酰胺或二甲亞砜將樣品溶解后再以流動相稀釋后進樣,樣品糊化現象依然嚴重;另外,通過降低樣品進樣量(如5μL),若使其峰面積在黃芪甲苷對照品的兩點之間(外標兩點法來計算含量),勢必降低對照品的濃度或進樣量,在儀器靈敏度已確定的情況,此法將大大受限,故未作相應的考察;最終選擇了對樣品溶解性能良好、可有效地消除溶劑效應對含量測定影響的90%甲醇作為樣品溶劑,經方法學驗證是合理、可行的,將更有利黃芪及其制劑的中黃芪甲苷的質量控制。

[1] WILLIAMSK J,LIWAN PO A,IRWINW J.Sample-solvent induced peak broadening in the reversed phase high performance liquid chromatography of aspirin and related analgesics[J].JChromatogr Sci,1980,194(2):217-223.

[2] TSIMIDOU M,MACRAE R.Influence of the injection solvent on the reversed-phase chromatography of triglycerides[J].J Chromatogr Sci,1984,285(1):178-181.

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[5] 王麗,申蘭慧,陳國清.淺談樣品溶劑對高效液相色譜行為的影響[J].中國藥事,2013,27(2):163-166.

[6] 梅雪.感毒清顆粒的藥學研究[D].成都:成都中醫藥大學,2012.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:283.

DOI 10.3870/yydb.2014.12.022

Effect of Different Sam p le Solvents on Determ ination of AstragalosideⅣby High Performance Liquid Chromatograph-Evaporative Light Scattering Detector

XU Jing1,LIU Tian-qiang1,PENG Heng-yang1,XIAO Dan1,2
(1.Tongwei Co.,Ltd,Chengdu 610041,China;2. Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective To explore the effect of sample-solvent compositions on the determination of AstragaliⅣby high performance liquid chromatograph-evaporative light scattering detector(HPLC-ELSD).MethodsRadix astragali andganduqinggranules served as samples.Methanol,90%methanol,80%methanol,70%methanol,32%acetonitrile,15%acetonitrile, and water were sample solvents.HPLC-ELSD was used to determine content of astragalosideⅣ.ResultsThe results showed that the 90%methanol solution was an appropriate sample solventwith good system suitability,precision,accuracy,and,linearityetc..ConclusionThismethod benefits the quality control of astragalosideⅣin Radix astragali and agents containing Radix astragali.

AstragaliⅣ;Sample-solvent;Solvent effect;Chromatograph,high performance liquid;Detector,evaporative light scattering

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)12-1624-04

2013-09-23

2014-03-14

*國家國際科技合作專項資助(2010DFA32380)

徐靜(1987-),男,四川南充人,工程師,碩士,主要從事藥物制劑與分析研究。電話:028-86168993,E-mail: 410744515@qq.com。

肖丹(1962-),女,四川成都人,教授,博士,主要從事藥劑學研究。電話:028-86168993,E-mail:xuj01@ tongwei.com。