環(huán)維黃楊星D對(duì)大鼠心力衰竭的治療作用

黃丹丹,邵靚婧,許立

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 1.藥品科;2.血液病科,南京 210002;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京 210029)

環(huán)維黃楊星D對(duì)大鼠心力衰竭的治療作用

黃丹丹1,邵靚婧2,許立3

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 1.藥品科;2.血液病科,南京 210002;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京 210029)

目的 通過(guò)觀察環(huán)維黃楊星D(CVB-D)對(duì)心力衰竭(心衰)大鼠心臟功能和心肌形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響,探討CVB-D對(duì)心衰的治療作用。方法結(jié)扎SD大鼠冠脈左前降支復(fù)制大鼠心衰模型,隨機(jī)分為5組,另加假手術(shù)組。應(yīng)用超聲心動(dòng)儀檢測(cè)心功能指標(biāo):左室后壁舒張期厚度(LVPWd)、左室后壁收縮期厚度(LVPWs)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、心率(HR)、心輸出量(CO)、左室短軸縮短率(LVSF)、每搏輸出量(SV);制作心肌組織切片,蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌組織學(xué)改變,透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果與模型對(duì)照組比較,CVB-D中、大劑量組EF、LVSF明顯增加(P＜0.05或P＜0.01),CVB-D小、中劑量組可見(jiàn)SV增加(P＜0.05),CVB-D小、中、大劑量組顯示CO增加(P＜0.05),CVB-D大劑量組顯示LVIDs減少,LVPWs增加(P＜0.05)。光鏡下CVB-D各劑量組使受損心肌組織出現(xiàn)不同程度的變化:心肌纖維排列逐漸整齊,橫紋逐漸明顯,輪廓逐漸清晰。透射電鏡下心肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化:CVB-D使受損心肌纖維斷裂減少,線粒體數(shù)量增多、腫脹變性減輕。結(jié)論CVB-D對(duì)心衰大鼠心臟收縮、泵血功能有明顯的改善作用,對(duì)心肌肌纖維、線粒體的損傷有緩解作用,推測(cè)CVB-D對(duì)心衰存在一定的治療作用。

環(huán)維黃楊星D;心力衰竭;心功能

環(huán)維黃楊星D(Cyclovirobuxine D,CVB-D)為黃楊生物堿中主要的有效單體。我國(guó)研究環(huán)維黃楊星D已有40年,取得了不少成果。臨床上廣泛用于治療心律失常、心絞痛、冠心病,尤其作為一種非苷類強(qiáng)心藥受到普遍關(guān)注[1-4]。CVB-D對(duì)心血管系統(tǒng)作用廣泛,對(duì)多種心血管疾病具有療效好、口服用藥安全、長(zhǎng)期應(yīng)用毒副作用低的特點(diǎn),這些為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)CVB-D提供了良好的基礎(chǔ)。筆者在本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制大鼠心力衰竭(心衰)模型,觀察CVB-D對(duì)心衰大鼠心功能和心肌形態(tài)的影響,從而探討CVB-D對(duì)心衰的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠:清潔級(jí),雄性,250～280 g,南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。合格證號(hào):SCXK(蘇)2013-0005,使用許可證號(hào):SYXK(蘇)2012-0042。實(shí)驗(yàn)大鼠正常給予飼料,飲水,室溫:20～25℃,相對(duì)濕度:60%～70%,保持通風(fēng)。

1.2 試劑 CVB-D:類白色結(jié)晶,由南京小營(yíng)藥廠提供,純度≥95%,批號(hào):X091027。CVB-D難溶于水,溶于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS),加入微量冰醋酸(終濃度不超過(guò)0.1%)全部溶解后,調(diào)pH到7.2。溶媒對(duì)照組:PBS溶液,pH調(diào)到7.2;地高辛片(上海信誼藥廠有限公司生產(chǎn),規(guī)格:0.25 mg,批號(hào):120103)。

1.3 儀器 Vevo770型高分辨小動(dòng)物超聲儀(加拿大Visualsonics公司),型號(hào):ALC-V8型動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特醫(yī)療儀器公司)。

1.4 造模與分組 結(jié)扎SD大鼠冠脈左前降支制造大鼠心衰模型:SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉,取仰臥位,固定四肢、牙齒于操作臺(tái)上。鈍性分離肌肉至氣管,插入氣管插管后接小動(dòng)物呼吸機(jī)[1,5-6]。2周后檢測(cè)超聲心動(dòng),以射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction,EF)＜50%為造模成功。造模成功后心衰大鼠隨機(jī)分為5組:模型對(duì)照組(12只),地高辛組(0.032 mg·kg-1)、CVB-D的小、中、大3個(gè)劑量(0.500,1.000,2.000 mg·kg-1)(各10只),另制備假手術(shù)組(8只),共計(jì)6組。連續(xù)灌胃60 d,qd,給藥體積:10 mL·kg-1。

1.5 觀察大鼠一般情況 存活率、飲食、活動(dòng)情況等。

1.6 超聲心動(dòng)指標(biāo) 左室后壁舒張期厚度(left ventricular posterior wall at end-diastole,LVPWd)、左室后壁收縮期厚度(left ventricular posterior wall at endsystole,LVPWs)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole, LVIDd)、EF、心率(heart rate,HR)、心排血量(cardiac output,CO)、左室短軸縮短率(left ventricular shortening fraction,LVSF)、每搏排血量(stroke volume,SV)。

1.7 病變嚴(yán)重程度 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色觀察病變嚴(yán)重程度,輕度“+”,中度“++”,重度“+++”。

1.8 透射電鏡觀察 心肌纖維、肌節(jié)、線粒體、質(zhì)膜等的變化。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 心衰模型對(duì)照組大鼠于灌胃給藥的第3天、第15天、第40天、第50天各死亡1只。地高辛組于給藥的第10天死亡1只。CVB-D小劑量組于給藥的第7天、第20天各死亡1只。CVB-D中劑量組于給藥第10天和第28天各死亡1只。CVB-D大劑量組于給藥第18天死亡1只。心衰大鼠隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)進(jìn)食減少、活動(dòng)量減少、腹水、足部水腫等。

2.2 心衰大鼠超聲心動(dòng)結(jié)果 與假手術(shù)組比較,模型對(duì)照組心衰大鼠EF、LVSF、SV、CO、LVPWs顯著減少; LVIDd、LVIDs則顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)。與模型對(duì)照組比較,CVB-D中、大劑量組EF、LVSF明顯增加(P＜0.05或P＜0.01),CVB-D小、中劑量組可見(jiàn)SV增加(P＜0.05);CVB-D小、中、大劑量組顯示CO增加(P＜0.05),CVB-D大劑量組顯示LVIDs減少, LVPWs增加(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 HE染色 假手術(shù)組:心臟心肌細(xì)胞橫紋清晰,未見(jiàn)增生肥大、萎縮、斷裂,無(wú)細(xì)胞變性、壞死等病變,間質(zhì)無(wú)水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),心外膜、心內(nèi)膜無(wú)異常。模型對(duì)照組:心臟大部分心肌細(xì)胞重度變性壞死(+++),間質(zhì)纖維結(jié)締組織重度增生(+++),伴輕度炎細(xì)胞浸潤(rùn)(+);部分心臟局灶性心肌細(xì)胞變性壞死(+),間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生(+)。CVB-D小、中、大劑量給藥組出現(xiàn)不同程度地變化,心肌纖維逐漸變細(xì)、肌纖維排列逐漸整齊,“分枝”狀與“漩渦”狀漸漸消失,細(xì)胞核染色變淺,相對(duì)均勻,且形狀整齊。見(jiàn)圖1。

2.4 透射電鏡 假手術(shù)組肌纖維排列有序、緊密,肌節(jié)排列正常,Z線清晰,線粒體大小較一致,質(zhì)膜清晰、完整,嵴清晰、致密。模型對(duì)照組肌纖維排列紊亂,絕大部分?jǐn)嗔?肌節(jié)萎縮、斷裂、排列無(wú)序、肌絲溶解,線粒體數(shù)量減少,腫脹變性明顯,質(zhì)膜部分破裂,嵴明顯減少、斷裂、變短、雜亂分布。CVB-D大劑量組肌纖維排列有所改善,肌纖維斷裂減少,線粒體數(shù)量增多,腫脹變性減輕。嵴增多,清晰度、致密度得到改善。見(jiàn)圖2。

3 討論

對(duì)于心衰的研究,無(wú)論是從治療技術(shù)方面還是藥物方面,最基本的就是建立心衰模型。復(fù)制動(dòng)物心衰模型的方法有許多種:冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法、冠狀動(dòng)脈堵塞法、主動(dòng)脈縮窄法、動(dòng)靜脈瘺法、心臟瓣膜關(guān)閉不全法、藥物損害法等[7]。本實(shí)驗(yàn)采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法,結(jié)扎左前降支,造成心肌急性梗死,隨著結(jié)扎時(shí)間的延長(zhǎng),心肌出現(xiàn)炎癥反應(yīng),梗死區(qū)域心室壁變薄,可觀察到左室腔擴(kuò)大,心肌收縮力明顯減弱。這類模型模擬心肌

梗死演變到心衰的病理過(guò)程,這一病理過(guò)程中心肌細(xì)胞、亞細(xì)胞的改變及心肌線粒體的變化與人類心衰相似[8]。此造模方法,相對(duì)其他方法而言,技術(shù)要求高,模型死亡率比一般方法高,造模時(shí)間相對(duì)長(zhǎng),其優(yōu)點(diǎn)在于模擬人類心衰,用于藥物研究更具有臨床意義[9]。

表1 6組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)指標(biāo)比較Tab.1 Com parison of cardiac function by echocardiography among six groups of rats ±s

表1 6組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)指標(biāo)比較Tab.1 Com parison of cardiac function by echocardiography among six groups of rats ±s

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別大鼠/只劑量/ (mg·kg-1) EF LVSF % SV/ μL HR/ (次·min-1)假手術(shù)組8…74.92±3.59*145.27±3.23*1229.42±47.09*2393.87±72.90模型對(duì)照組8…36.78±10.77 18.88±6.12 181.64±36.57 422.50±49.79地高辛組9 0.032 51.23±8.80*227.74±5.72*1249.73±47.09 431.12±22.79 CVB-D小劑量組8 0.500 46.49±9.39 24.67±5.69 227.51±39.54*2420.00±87.78中劑量組8 1.000 50.84±11.97*227.57±7.45*2229.11±37.28*2414.62±57.10大劑量組9 2.000 53.10±5.15*128.82±3.43*1mm假手術(shù)組96.95±23.63*22.01±0.15 3.17±0.23*27.56±0.77*14.14±0.57*1256.66±35.88 385.25±92.71組別CO/ (mL·min-1) LVPWd LVPWs LVIDd LVIDs模型對(duì)照組70.98±15.97 2.02±0.18 2.70±0.33 9.56±0.97 7.79±1.31地高辛組76.60±7.49*22.12±0.33 3.08±0.41*29.40±0.72 6.81±0.98 CVB-D小劑量組94.73±24.16*21.94±0.20 3.06±0.18 9.49±1.39 7.21±1.54中劑量組95.94±25.53*21.91±0.26 3.05±0.46 9.14±0.97 6.67±1.34大劑量組95.21±28.45*22.07±0.24 3.41±0.42*29.31±0.68 6.64±0.68*2

A.假手術(shù)組;B.模型對(duì)照組;C.地高辛組;D.CVB-D小劑量組;E.CVB-D中劑量組;F.CVB-D大劑量組圖1 6組大鼠心臟組織HE染色圖(×200)A.sham group;B.model group;C.digoxin group;D.low-dose CVB-D group;E.middle-dose CVB-D group;F.high-dose CVB-D groupFig.1 HE staining on cardiac tissue of six groups of rats(×200)

A.假手術(shù)組;B.模型對(duì)照組;C.地高辛組;D.CVB-D大劑量組圖2 4組大鼠心臟組織透射電鏡檢查結(jié)果(×25 000)A.sham operation group;B.model group;C.digoxin group;D.high-dose CVB-D groupFig.2 Detection results of cardiac tissue in four groups of rats by transm ission electron m icroscopy(×25 000)

采用超聲心動(dòng)指標(biāo)來(lái)診斷大鼠心衰模型是否成功,同時(shí)采用超聲心動(dòng)相關(guān)指標(biāo)及參數(shù)的改變來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)心衰大鼠的療效[10]。此方法是一個(gè)無(wú)創(chuàng)傷性的檢驗(yàn)方法,避免了因?yàn)閯?chuàng)傷而導(dǎo)致的誤差[11],而且又可以連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察模型動(dòng)物的心功能狀態(tài),因此超聲心動(dòng)圖能很好地評(píng)價(jià)心衰動(dòng)物模型的成功與否,科學(xué)實(shí)驗(yàn)中值得推廣和使用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):模型對(duì)照組大鼠的心功能較假手術(shù)組有顯著下降,模型對(duì)照組大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)EF＜47%,假手術(shù)組大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)EF＞70%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明造模成功。造模成功后給藥,CVB-D小、中、大(0.500,1.000和2.000 mg·kg-1)3個(gè)劑量組,給藥60 d后結(jié)果顯示CVB-D對(duì)心衰大鼠心臟收縮和泵血功能有明顯的改善作用,從而推測(cè)CVB-D對(duì)心衰存在一定的治療作用。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):CVB-D使受損的心肌組織發(fā)生了形態(tài)學(xué)改變,主要表現(xiàn)為肌纖維排列整齊,橫紋出現(xiàn)且輪廓清晰,心肌細(xì)胞變性壞死減輕。同時(shí)受損心肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化:肌纖維斷裂減少,線粒體數(shù)量增多,腫脹變性減輕。嵴增多,清晰度、致密度得到改善。線粒體對(duì)心肌細(xì)胞生理功能的維持具有重要作用,同時(shí)線粒體的氧化代謝與心肌收縮的能源和張力密切相關(guān),其線粒體結(jié)構(gòu)的完整性與心肌功能緊密相連。因此, CVB-D能夠改善受損心肌的形態(tài)和結(jié)構(gòu),對(duì)心衰的心臟起到一定的改善作用。

綜上所述,CVB-D對(duì)大鼠的心衰有一定治療作用,此作用與改善心功能,改善心肌形態(tài)和結(jié)構(gòu)有關(guān)。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.006

Therapeutic Effects of Cyclovirobuxine D on Rats with Heart Failure

HUANG Dan-dan1,SHAO Jing-jing2,XU Li3
(1.Department of Pharmacy;2.Department of Hematology, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command,Nanjing 210002,China;3.School of Pharmacy, Nanjing University ofChinese Medicine,Nanjing 210029,China)

Objective To explore the therapeutic effect of cyclovirobuxine-D(CVB-D)on heart failure by observing the influences of CVB-D on cardiac function,myocardialmorphology and structure in ratswith heart failure.MethodsThe rat model of heart failure was established by ligating left anterior descending coronary artery,and then the ratswere randomly divided into 5 groups,plus the sham group.Echocardiography was used to assess cardiac function,including EF,LVSF,SV,HR,CO and so on.Myocardial tissue section was obtained.Change in the myocardial tissue was observed by HE staining.Myocardial ultrastructure was observed by using transmission electronmicroscope.ResultsAs compared with themodel group,EF and LVSF were significantly increased inmedium and high dose CVB-D groups(P＜0.05 orP＜0.01),SV was increased in low andmedium dose CVB-D groups(P＜0.05),CO was increased in low,medium and high dose CVB-D groups(P＜0.05),LVIDs was decreased and LVPWs was increased in high dose CVB-D group(P＜0.05).Under light microscope,changes of myocardial structureswere observed in different CVB-D dose groups:myocardial fiber gradually became tidy,stripes became clear,and contour became clear.The changes of myocardial ultra-structure were observed under transmission electron microscope:the myocardial fiber breakage was reduced and the number ofmitochondria was increased,swelling degeneration was alleviated.ConclusionCVB-D significantly improved cardiac contraction and blood pumping function of rats with heart failure,exerted mitigative effect on damage of cardiacmuscle fiber and mitochondria.It suggests that CVB-Dmay be effective in the treatment of heart failure.

Cyclovirobuxine D;Heart failure;Heart function

R285.5;R541

A

1004-0781(2014)12-1562-04

2013-12-25

2014-04-17

黃丹丹(1982-),女,江蘇南通人,藥師,碩士,研究方向:臨床藥學(xué)。電話:(0)13404166202,E-mail: huangdandan2002@sohu.com。

許立(1964-),男,江蘇南通人,教授,博士,研究方向:藥理學(xué)。電話:(0)13851572203,E-mail:xuli64@163. com。