蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠的保護作用*

趙永明,王金,石紅,劉紅彬,鄭麗卿,董曉華

(1.河北北方學院藥學系,張家口 075000;2.浙江九旭藥業有限公司,金華 321016)

蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠的保護作用*

趙永明1,王金1,石紅2,劉紅彬1,鄭麗卿1,董曉華1

(1.河北北方學院藥學系,張家口 075000;2.浙江九旭藥業有限公司,金華 321016)

目的 觀察蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠的保護作用。方法采用線栓法制備局灶性腦缺血-再灌注模型,在腦缺血2 h再灌注24 h后,對大鼠神經功能進行評分,并測定腦梗死體積;同時測定腦組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)及線粒體中ATP酶的含量。結果與模型對照組比較,蛇床子素能降低腦梗死體積、改善腦缺血-再灌注大鼠神經功能,升高SOD活性、增加GSH含量,同時降低MDA含量。結論蛇床子素對大鼠腦缺血-再灌注損傷有保護作用。

蛇床子素;缺血-再灌注,腦;自由基

缺血性腦血管疾病是神經系統的常見疾病,由于發病率高、容易致殘而嚴重影響公眾健康,探索有效的預防與治療措施具有積極的社會意義。蛇床子素(Osthole),化學名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素,分子式C15H16O3,是傘形科植物蛇床子中提取得到的一種香豆素類單體。目前研究證實蛇床子素具有改善學習記憶[1-2]、清除自由基[3]、抑制血細胞聚集和血栓形成[4]等作用。本實驗制備與臨床發病情況相似的大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型,進一步研究蛇床子素對局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠的腦保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley, SD)大鼠72只,體質量260～290 g,北京大學醫學部實驗動物中心提供(動物生產許可證號:SCXK(京) 2006-0008)。動物飼養于SPF級動物房中。

1.2 藥物及試劑 蛇床子素(西安開來生物工程有限公司,純度＞98%),尼莫地平(拜耳醫藥保健有限公司,批號:122514);氯代三苯基四氮唑(TTC,天津巴斯夫化工有限公司,分析純);丙二醛(malondialdehyde, MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒均購自碧云天生物技術研究所,Na+-K+-ATP ase、Ca2+-Mg2+-ATP ase試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 分組與模型構建 大鼠隨機分為6組,即假手術組、模型對照組、蛇床子素小、中、大劑量組(4,8, 16 mg·kg-1)和尼莫地平組(4 mg·kg-1),每組12只。缺血后1 h分別腹腔注射蛇床子素和尼莫地平, qd,連續給藥14 d,假手術組和模型對照組腹腔注射等體積的溶劑。給藥劑量參照文獻報道[5-6]。采用Longa法制備大鼠右側大腦中動脈(middle cerebral artery occlusion,MCAO)局灶性腦缺血-再灌注損傷模型[7]。在腦缺血2 h再灌注24 h后,每組取6只大鼠迅速斷頭處死,取腦,去除腦膜和血液,用磷酸鹽緩沖溶液制備10%腦組織勻漿。部分勻漿液經1 000 r·min-1離心10 min后,取上清液繼續12 000 r·min-1離心15 min,沉淀物加0.9%氯化鈉溶液即為線粒體懸液。

1.4 神經功能行為評分 按Longa評分法,于缺血2 h、再灌注22 h對實驗大鼠進行神經功能評分,標準如下:0分,無神經功能缺失;1分,輕微局灶性神經缺陷(左側前爪不能完全伸直);2分,中度局灶性神經缺陷(向左側旋轉);3分,嚴重的局灶性神經缺陷(行走時向左側傾斜);4分,不能行走[7]。

1.5 大鼠腦組織勻漿SOD、MDA、GSH的測定 分別取腦組織勻漿和線粒體懸液,其余操作嚴格按照試劑盒說明書進行,分別測定SOD、MDA和GSH含量。

1.6 線粒體組分ATP酶的測定 取線粒體懸液,按試劑盒操作說明測定Na+-K+-ATP ase,Ca2+-Mg2+-ATP ase活性。

1.7 腦梗死體積測定 在腦缺血2 h再灌注24 h后,迅速斷頭處死大鼠,取腦,用腦切片器間隔2 mm連續切片,共做冠狀切片6個,置2%TTC溶液中,37℃水浴孵育30 min,然后用10%甲醛固定。染色后由于TTC被還原,最終正常腦組織呈紅色,而缺血區呈白色;拍照后用計算機圖像分析系統測定梗死面積,最后計算總梗死體積,以缺血損傷區占全腦體積的百分比評價腦損傷程度[8-9]。

2 結果

2.1 蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠神經功能評分的影響 各組大鼠于MCAO術后,除假手術組外,其余各組大鼠均出現不同程度的神經運動功能障礙,主要表現為前肢肌張力降低、活動時步態不穩(向左側傾倒或轉圈)、提尾懸空時前肢內收等。蛇床子素小、中、大劑量組,尼莫地平組對缺血-再灌注損傷大鼠神經功能障礙均有改善作用,與模型對照組比較,差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。見表1。

2.2 蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠線粒體組分ATP酶的影響 腦缺血-再灌注24 h,與假手術組比較,模型對照組大鼠線粒體中Na+-K+-ATP ase,Ca2+-Mg2+-ATP ase活性明顯降低;而蛇床子素藥物組和尼莫地平組Na+-K+-ATP ase,Ca2+-Mg2+-ATP ase活性則明顯升高。見表2。

2.3 蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織SOD、MDA、GSH的影響 與假手術組大鼠比較,模型對照組大鼠SOD活性明顯降低,MDA含量明顯升高,而GSH含量則顯著降低。小、中、大劑量蛇床子素和尼莫地平可在一定程度上逆轉上述作用,能升高SOD活性、增加GSH含量,同時降低MDA含量。見表3。

表1 6組大鼠神經功能評分比較Tab.1 Comparison of neurological scores among six groups of rats 分±s

表1 6組大鼠神經功能評分比較Tab.1 Comparison of neurological scores among six groups of rats 分±s

與模型對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

神經功能評分假手術組12…組別大鼠/只劑量/ (mg·kg-1) 0.00±0.00模型對照組12…3.48±0.57尼莫地平組12 4 1.93±0.46*1蛇床子素小劑量組12 4 2.75±0.39*2中劑量組12 8 1.62±0.34*1大劑量組12 16 1.33±0.28*1

表2 6組大鼠腦組織線粒體ATP酶活性比較Tab.2 Comparison of m itochondrial ATPase activity in brain among six groups of rats ±s

表2 6組大鼠腦組織線粒體ATP酶活性比較Tab.2 Comparison of m itochondrial ATPase activity in brain among six groups of rats ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared withmodel control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別大鼠/只劑量/ (mg·kg-1) Na+-K+-ATP Ca2+-Mg2+-ATP (mmol·g-1·h-1)假手術組6…? 6.02±0.77 6.84±1.37模型對照組6…3.34±0.53 3.97±0.81尼莫地平組6 4 5.25±0.42*16.01±0.63*1蛇床子素小劑量組6 4 3.65±0.61 4.68±0.66中劑量組6 8 4.42±0.76*25.32±1.01*2大劑量組6 16 4.73±0.88*15.66±1.13*1

2.4 蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦梗死體積的影響 腦缺血-再灌注24 h,發現除假手術組外,模型對照組、蛇床子素組和尼莫地平組大鼠腦組織均有不同程度梗死。與模型對照組比較,蛇床子素小劑量、中劑量、大劑量組和尼莫地平組腦梗死體積顯著降低。見圖1,表4。

3 討論

腦缺血-再灌注時,毛細血管周圍會產生大量自由基。自由基進一步攻擊神經細胞膜,損傷血-腦脊液屏障,引發脂質過氧化,促進腦水腫形成,最終導致細胞膜功能缺失、線粒體受損或者神經元死亡[10]。MDA作為脂質過氧化的中間產物,能夠反映體內自由基的數量及脂質過氧化程度;SOD的活性變化則表達機體清除自由基的能力。本實驗觀察到,大鼠腦缺血2 h,再灌注24 h后,與假手術組比較,模型對照組腦組織勻漿SOD活性、GSH含量明顯降低,MDA含量明顯升高;與模型對照組比較,藥物組腦組織勻漿中SOD活性增強、MDA含量降低,表明蛇床子素對腦缺血-再灌注損傷時產生的自由基具有清除作用。

線粒體是細胞內的主要產能部位,當腦缺血缺氧發生時,線粒體功能降低,ATP量減少,使Na+-K+-ATP ase和Ca2+-Mg2+-ATP ase活性降低,最終細胞內Na+和Ca2+超載,進一步加重腦缺血-再灌注損傷[11]。本實驗發現蛇床子素能抑制腦缺血-再灌注大鼠線粒體ATP ase活性降低,增強自由基清除能力,減少脂質過氧化物的生成,從而起到保護線粒體作用。

綜上所述,蛇床子素對局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠有明顯的線粒體保護作用和自由基清除作用,這可能是其保護缺血腦組織的作用機制之一。

表3 6組大鼠腦組織SOD、MDA、GSH水平比較Tab.3 Comparison of the content of SOD,MDA and GSH in brain among six groups of rats ±s

表3 6組大鼠腦組織SOD、MDA、GSH水平比較Tab.3 Comparison of the content of SOD,MDA and GSH in brain among six groups of rats ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05

組別大鼠/只劑量/ (mg·kg-1) SOD/ (U·mg-1) MDA/ (μmol·g-1) GSH/ (mg·g-1)假手術組6…202.49±12.37 20.35±4.69 85.24±14.83模型對照組6…118.17±20.74 47.53±7.94 53.67±15.94尼莫地平組6 4 176.24±4.57*128.83±5.17*170.22±17.34*1蛇床子素小劑量組6 4 136.52±28.73*242.35±3.69 58.14±13.66中劑量組6 8 158.32±20.15*135.12±4.07*166.28±12.83*1大劑量組6 16 181.36±22.48*131.63±5.74*168.39±13.43*1

A.假手術組;B.模型對照組;C.尼莫地平組;D.蛇床子素小劑量組;E.蛇床子素中劑量組;F.蛇床子素大劑量組圖1 6組大鼠腦組織TTC染色圖A.sham group;B.model control group;C.nimodipine group;D.low-dose osthole group;E.medium-dose osthole group;F.high-dose osthole groupFig.1 TTC staining on brain of six groups of rats

表4 6組大鼠腦梗死體積比較Tab.4 Effect of osthole on the infarct volum e of six groups of rats ±s

表4 6組大鼠腦梗死體積比較Tab.4 Effect of osthole on the infarct volum e of six groups of rats ±s

與模型對照組比較,*1P＜0.01Compared withmodel control group,*1P＜0.01

組別大鼠/劑量/相對腦梗死只(mg·kg-1)體積/%假手術組6…0.00±0.00模型對照組6…35.34±4.52尼莫地平組6 4 12.66±1.94*1蛇床子素小劑量組6 4 27.33±3.89*1中劑量組6 8 22.15±3.76*1大劑量組6 16 16.78±3.46*1

[1] 龔其海,丁利靜,王麗娜,等.蛇床子素減輕脂多糖誘導的大鼠學習記憶減退[J].中國新藥與臨床雜志,2011, 30(8):609-614.

[2] 沈麗霞,張丹參,任雷鳴,等.蛇床子素對學習記憶的影響及機制分析[J].藥學學報,1999,34(6):405-409.

[3] 王書華,安芳,張丹參.蛇床子素抗氧自由基清除作用的研究[J].中成藥,2004,26(12):1062-1063.

[4] 陳蓉,謝梅林,周佳.蛇床子素抑制血栓形成和血小板聚集的實驗研究[J].中國藥理學通報,2005,21(4):440-443.

[5] 何蔚,劉建新,周鈺梅,等.蛇床子素對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護作用及其機制[J].中國藥理學通報, 2008,24(11):1528-1530.

[6] 董曉華,張丹參,張力,等.蛇床子素對腦缺血-再灌注大鼠海馬LTP及氨基酸含量的影響[J].中國藥理學通報, 2011,27(9):1267-1271.

[7] LONGA E Z,WEINSTEIN P R,CARLSON S,et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[8] FISKUM G,MURPHY A N,BEAL M F.Mitochondrial in neurodegeneration acute ischemia and chronic neurodegenerative disease[J].JBlood Flow Meta,1999,19 (4):351-369.

[9] 唐焜,謝小慧,陳志達,等.仙人掌多糖對大鼠局灶性腦缺血的神經保護作用[J].醫藥導報,2012,31(9):1109-1112.

[10] FARACIFM,BRIAN JE.Free radicals in central nervous system ischemia[J].Stroke,1990,21(7):1086-1990.

[11] 劉穎,紀超,吳偉康.附子多糖對缺氧/復氧乳鼠心肌細胞的保護機制[J].中國現代應用藥學,2012,29(4): 281-284.

DOI 10.3870/yydb.2014.12.005

Protective Effects of Osthole on Rats with Focal Cerebral Ischem ia-reperfusion Injury

ZHAO Yong-ming1,WANG Jin1,SHI Hong2,LIU Hong-bin1,ZHENG Li-qing1,DONG Xiao-hua1
(1. Department ofPharmacy,HebeiNorth University,Zhangjiakou 075000,China;2.Zhejiang Jiuxu Pharmaceutical Co.,Ltd,Jinhua 321016,China)

Objective To investigate the potential mechanism and protective effects of osthole on rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury.MethodsMiddle cerebral artery occlusion was induced by the suture-occluded method. After 2 h of cerebral ischemia and 24 h of reperfusion,scores ofneurological deficits and infarct volumewere evaluated.The levels of SOD,MDA,GSH and ATPase were also determined.ResultsScores of neurological deficits and infarct volume were lower in the osthole groups than in themodel group.Meanwhile,the activity of SOD and GSH content were increased,while the MDA contentwas decreased in osthole groups.ConclusionOsthole exerts protective effects on rats with focal cerebral ischemiareperfusion injury.

Osthole;Ischemia-reperfusion,brain;Free radical

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)12-1558-04

2013-11-26

2014-02-22

*河北省衛生廳資助項目(20110173, 20120155);河北省教育廳資助項目(Z2011304);河北省科技廳資助項目(13272704D)

趙永明(1978-),女,河南汝南人,講師,碩士,從事中藥新藥開發研究。電話:0313-4029305,E-mail:zym2167 @163.com。