絞股藍皂苷對2型糖尿病并發非酒精性脂肪性肝病大鼠脂質過氧化的影響*

賀琴,李芳,譚華炳

(湖北醫藥學院附屬人民醫院1.感染性疾病科肝病研究室;2.藥學部,十堰 442000)

絞股藍皂苷對2型糖尿病并發非酒精性脂肪性肝病大鼠脂質過氧化的影響*

賀琴1,2,李芳1,譚華炳1

(湖北醫藥學院附屬人民醫院1.感染性疾病科肝病研究室;2.藥學部,十堰 442000)

目的 觀察絞股藍皂苷(GPS)對2型糖尿病(T2DM)并發非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠脂質過氧化和肝損傷的影響。方法65只SPF級雄性SD大鼠隨機分為空白對照組(N組),NAFLD模型組(NM組),T2DM并NAFLD模型組(M組),T2DM并NAFLD模型大鼠再分別給予GPS(1 g·kg-1·d-1)干預(JH組),GPS (0.5 g·kg-1·d-1)干預(JL組),而M組以純凈水灌胃作為對照。檢測血糖(BS)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、脂聯素(ADP);檢測肝組織TG、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。結果ADP結果:N組、M組、NM組、JH組、JL組依次為(7.46±1.12),(3.58±0.98),(4.89±1.02),(4.79± 1.01),(4.13±0.89)ng·mL-1,JH組、JL組高于M組(P＜0.01),JH組高于JL組(P＜0.05)。MDA結果:N組、M組、NM組、JH組、JL組依次為(2.98±0.09),(4.22±0.11),(3.66±0.10),(3.72±0.11),(3.99±0.13)nmol·mL-1,JH組、JL組低于M組(P＜0.01),JH組低于JL組(P＜0.05)。SOD結果:N組、M組、NM組、JH組、JL組依次為(240.8±17.4), (149.9±20.6),(181.6±19.4),(209.8±19.2),(189.4±18.9)U·mL-1,JH組、JL組高于M組(P＜0.01),JH組高于JL組(P＜0.05)。肝組織TG結果:N組、M組、NM組、JH組、JL組依次為(28.98±1.68),(214.46±5.44),(198.46±6.98), (142.87±6.64),(164.92±7.56)mg·g-1;JH組、JL組低于M組(P＜0.01),JH組低于JL組(P＜0.05)。ALT、AST結果:與M組比較,JH組、JL組ALT、AST下降,差異有統計學意義(P＜0.01),JH組低于JL組(P＜0.05)。結論GPS能降低T2DM并NAFLD大鼠脂質過氧化程度,通過抑制脂質過氧化抑制肝損傷。

絞股藍皂苷;糖尿病,2型;肝病,脂肪性,非酒精性;脂質過氧化;損傷,肝

到2025年我國將有2億人罹患糖尿病[1],其中約95%為2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)。T2DM與非酒精性脂肪性肝病(nonalcohol fatty liver disease,NAFLD)互為因果:T2DM患者NAFLD檢出率為50.45%[2]。NAFLD通過非酒精性脂肪性肝炎(non alcoholic steatohepatitis,NASH)發展為NASH相關肝硬化、肝癌[3-4]。NAFLD導致高脂血癥、動脈粥樣硬化、T2DM[5-7]。NAFLD的“二次打擊”學說認為,肥胖、T2DM、高脂血癥等伴隨的胰島素抵抗(insulin resistance,IR)導致第一次打擊;脂質過量沉積的肝細胞發生氧化應激和脂質過氧化,導致線粒體功能障礙、炎癥遞質產生,肝星狀細胞的激活,產生肝細胞的炎癥壞死和纖維化是第二次打擊[8]。針對T2DM并發NAFLD,既要關注第一次打擊,還要關注第二次打擊。研究發現,絞股藍皂苷(gypenosides,GPS)能降低T2DM并NAFLD大鼠三酰甘油(triglycerides,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、血糖(blood sugar, BS)[9],下調肝組織腫瘤壞死因子-αmRNA(tumor necrosis factor alphamRNA,TNF-αmRNA)表達[10],抑制肝組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARγ)表達的下降,且呈劑量依賴性[11]。筆者通過檢測肝組織TG、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、血脂聯素(adiponectin, ADP)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartale aminotransferase,AST),觀察GPS是否通過抗脂質過氧化作用干預NAFLD程度、預防NASH導致的肝損害。

1 材料與方法

1.1 動物 65只SPF級雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠,體質量220～250 g,由湖北醫藥學院動物實驗中心提供,合格證號:SCXK(湘) 2009-0004。實驗場地:湖北省十堰市實驗動物中心,實驗動物設施使用證明號:00015644。

1.2 實驗飼料 普通飼料由湖北醫藥學院動物實驗中心提供。膽固醇購自北京雙旋生物培養基制品廠。豬油由市售板油自行煉制而成,蛋黃粉由市售雞蛋自行制作。高糖高脂飼料由湖北醫藥學院動物實驗中心按實驗配方配制成成品使用(配方:78%普通飼料+ 2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油+4.5%蔗糖)。高脂飼料由湖北醫藥學院動物實驗中心按照實驗設計配方配制成成品使用(配方:82.5%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油)。

1.3 試劑 BS、TG、TC、ALT、AST檢測試劑為瑞士Roche/Hitache公司原裝進口試劑,SOD、MDA檢測試劑購自南京建成科技有限公司。血清脂聯素ELISA試劑盒為GBD公司生產(檢測范圍0～50 ng·mL-1)。鏈尿佐菌素(streptozotocin,STZ)購于美國Sigma公司。GPS購自安康東科麥迪森天然藥業有限公司,純度為98%。

1.4 儀器 Hitache7600全自動生化檢測儀(瑞士Roche公司)。DL-45R-L冷凍低溫離心機(上海中科生物醫學高科技開發有限公司)。紫外光分光光度計(北京北方華粵貿易有限公司)。德國組織勻漿機。

1.5 實驗模型的建立 參照文獻[12],大鼠普通飼料飼養觀察1周,動物無死亡及不良反應。按實驗設計將65只大鼠分為空白對照組(N組,7只),NAFLD模型組(NM組,7只),T2DM并NAFLD模型組(51只)。模型組每鼠每天高糖高脂飼料約20 g,分兩次投入,喂養4周,大鼠隔夜空腹腹腔注射STZ 40 mg·kg-1,48 h后尾靜脈取血,血糖＞11.1 mmol·L-1,納入實驗組,造模成功率為100%;繼續予高糖高脂飼料喂養至8周,建立T2DM并NAFLD模型。期間大鼠死亡15只。將T2DM并NAFLD模型大鼠分為GPS大劑量組(JH組,9只)予以GPS1 g·kg-1·d-1灌胃;GPS小劑量組(JL組,9只)予以GPS 0.5 g·kg-1·d-1灌胃;模型對照組(M組,9只)予同等體積的純化水灌胃。繼續給予高糖高脂飼料,自由飲水。治療周期為6周;實驗周期14周。N組每天給予普通飼料約20 g(根據NAFLD組進食量調整);NM組予以高脂飼料約20 g(依據前一天進食量決定第2天進食量),飼料分2次投入,自由飲水。實驗周期14周。

1.6 標本的采集與檢測

1.6.1 血液標本的采集與處理 參照文獻[9]。

1.6.2 肝組織勻漿的制備 在肝臟最大葉邊緣0.5 cm處取小塊肝組織一塊,冰0.9%氯化鈉溶液沖洗,濾紙吸干,稱取0.5 g置于預冷的0.9%氯化鈉溶液5 mL,迅速用內切式勻漿機4 000 r·min-1勻漿每次10 s,間隙30 s,連續3次,碎冰塊中制成10%的肝勻漿,高速冷凍離心機4℃、3 000 r·min-1離心10 min,取上清液3 mL密封,-20℃冷凍待檢。

1.6.3 肝組織SOD、MDA的檢測 取肝組織勻漿,分別采用黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法,按試劑說明書逐步進行。

1.6.4 ADP檢測 取適量血清分別嚴格按試劑盒說明書測定空腹ADP,ADP測定采用酶聯免疫法。

1.6.5 肝組織勻槳TG測定 按照設備操作常規進行。

1.6.6 TG、TC、BS、ALT、AST檢測 按照設備、試劑操作常規進行。

1.7 統計學方法 本研究采用完全隨機化設計,數據采用SPSS17.0版統計軟件包進行統計學處理。計量資料用均數±標準差(±s)表示,組間比較及各組之間兩兩比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗過程中大鼠數量變化 模型組在T2DM并NAFLD造模過程中,死亡大鼠15只;在干預過程中, JH組、JL組、M組分別有1,2,3只大鼠死亡,實驗結束JH組實有大鼠8只,JL組實有大鼠7只,M組實有大鼠6只。NM組實驗過程中死亡1只,實有大鼠6只。N組大鼠飼養過程中無死亡。

2.2 MDA結果 M組、NM組、JH組、JL組上升,與N組比較,差異有統計學意義(P＜0.01);JH組與M組比較差異有統計學意義(P＜0.01);JL組與M組比較,差異有統計學意義(P＜0.05);JH組低于JL組,比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 SOD結果 M組、NM組、JH組、JL組下降,與N組比較,差異有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05);JH組、JL組與M組比較,差異有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05);JH組高于JL組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.4 肝組織TG濃度 NM組、JH組、JL組、M組肝組織TG上升,與N組比較,差異有統計學意義(P＜ 0.01);JH組、JL組低于M組,差異有統計學意義(P＜0.01或P＜0.05);JH組低于JL組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.5 ADP、ALT、AST結果 ADP結果:與N組比較, M組、NM組、JH組、JL組水平顯著下降,差異有統計學意義(P＜0.01);JH組高于M組,差異有統計學意義(P＜0.01);JL組高于M組,差異有統計學意義(P＜0.05);JH組高于JL組,差異有統計學意義(P＜0.05)。ALT、AST結果:與N組比較,M組、NM組、JH組、JL組ALT、AST上升,差異有統計學意義(P＜0.01);JH組、JL組低于M組,差異有統計學意義(P＜0.01);JH組低于JL組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

2.6 BS、TG、TC結果 M組、NM組、JH組、JL組與N組比較,差異有統計學意義(P＜0.01);JH組、JL組與M組比較,差異有統計學意義(P＜0.01)[9]。

3 討論

本研究主要關注GPS是否通過抑制脂質過氧化達到抑制脂肪肝效果。研究通過與M組、N組、NAFLD組對比,觀察GPS大劑量、小劑量對模型大鼠MDA、SOD、APN、ALT、AST變化,以肝組織TG沉積量觀察脂肪肝程度,了解GPS抗脂質過氧化作用,以及對NASH抑制作用。

與N組比較,NAFLD組、JH組、JL組、M組肝組織脂質沉積量上升,JH組、JL組與M組比較顯著下降,說明GPS具有抑制肝組織脂質沉積作用,具有抑制脂質過氧化的基礎。

與N組比較,NAFLD組、JH組、JL組、M組肝組織MDA上升,JH組、JL組與M組比較顯著下降。與N組比較,NM組、JH組、JL組、M組肝組織SOD、ADP下降,JH組、JL組與M組比較顯著上升。

MDA是脂質過氧化產物,T2DM并NAFLD患者MDA升高[13];肝臟組織含有SOD等抗氧化酶,T2DM并NAFLD大鼠肝組織SOD含量顯著下降[14];ADP是由脂肪細胞分泌的一種細胞因子,參與糖、脂代謝,具有改善胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用[15]。說明T2DM并NAFLD大鼠脂質過氧化加重,抗脂質過氧化能力下降,胰島素敏感性下降,炎癥反應上升,“第二次打擊”導致NAFLD程度加重。GPS通過抑制脂質過氧化達到降低“第二次打擊”程度,抑制脂肪肝的目的,呈劑量依賴性。

表1 5組大鼠肝組織MDA、SOD、TG測定值Tab.1 Determ ination results of MDA、SOD、TG in liver tissue in five groups of rats ±s

表1 5組大鼠肝組織MDA、SOD、TG測定值Tab.1 Determ ination results of MDA、SOD、TG in liver tissue in five groups of rats ±s

與N組比較,*1P＜0.01,*4P＜0.05;與M組比較,*2P＜0.01,*3P＜0.05Compared with group N,*1P＜0.01,*4P＜0.05;compared with group M,*2P＜0.01,*3P＜0.05

組別大鼠/只MDA/(nmol·mL-1)SOD/(U·mL-1)TG/(mg·g-1) N組2.98±0.09 240.8±17.4 28.98±1.68 M組6 4.22±0.11*1149.9±20.6*1214.46±5.44*1NM組6 3.66±0.10*1*2181.6±19.4*1*3198.46±6.98*1*3JH組8 3.72±0.11*1*2209.8±19.2*2*4142.87±6.64*1*2JL組7 3.99±0.13*1*3189.4±18.9*1*3164.92±7.56*1*27

表2 5組大鼠血ADP、ALT、AST測定值Tab.2 Determ ination results of the plasma level of ADP,ALT and AST in five groups of rats ±s

表2 5組大鼠血ADP、ALT、AST測定值Tab.2 Determ ination results of the plasma level of ADP,ALT and AST in five groups of rats ±s

與N組比較,*1P＜0.01;與M組比較,*2P＜0.01,*3P＜0.05Compared with group N,*1P＜0.01;compared with group M,*2P＜0.01,*3P＜0.05

組別大鼠/只ADP/ (ng·m L-1) ALT AST (U·L-1) N組7.46±1.12 46.7±8.2 59.9±8.8 M組6 3.58±0.98*1 148.4±10.1*1 169.1±14.9*1NM組6 4.89±1.02*1*2 80.8±11.3*1*2 91.6±10.6*1*2JH組8 4.79±1.01*1*2 88.9±10.4*1*2 96.3±11.2*1*2JL組7 4.13±0.89*1*2 110.2±11.6*1*3 129.7±12.3*1*37

ALT、AST升高說明發生了NASH并導致肝損害,數據反映了肝細胞受損的程度。與N組比較,NM組、JH組、JL組、M組血清ALT、AST上升,JH組、JL組與M組比較顯著下降。說明T2DM并NAFLD導致肝細胞損害,GPS具有減輕NASH、保護肝細胞作用。由于T2DM并NAFLD患者多存在肝功能障礙,而臨床治療糖尿病的常用藥物,大多在肝臟進行代謝,長期應用可能會加重脂肪蓄積和肝功能損害[16]。從保護肝臟的角度,使用GPS有利于保護T2DM并NAFLD的肝功能。

現代藥理研究證明,絞股藍含有83種與人參皂苷有類似骨架的達瑪烷型絞股藍皂苷,皂苷具有抗炎、降低血脂、降血糖和免疫調節等多方面的生物活性和藥理作用[17],NORBERG等[18]從絞股藍中分離提純出一種新的皂苷,存在4種可以相互轉化的立體異構體,在體外及動物實驗中均發現,其可刺激胰島細胞釋放胰島素,且呈現劑量依賴性。XU等[19]對絞股藍中分離得到的皂苷及其衍生物的降糖作用進行了研究,發現其可以通過抑制蛋白酪氨酸磷脂酶來控制胰島素的敏感度。說明GPS通過刺激胰島素分泌、提高胰島素敏感性、調節血糖代謝、調節血脂代謝抑制“第一次打擊”,通過抗纖維化[20]、抑制脂質過氧化、抗炎抑制“第二次打擊”,多靶點抑制T2DM并NAFLD脂肪肝的進程。

[1] YOON K H,LEE JH,KIM JW,etal.Epidemic obesity and type 2 diabetes in Asia[J].Lancet,2006,368(9548): 1681-1688.

[2] 李勇杰,蘇宏業,李圣琦.2型糖尿病患者非酒精性脂肪肝檢出率及臨床特點[J].廣西醫學,2012,34(1):86-88.

[3] FARRELL G C,CHITTURIS,LAU G K,et al.Asia-Pacific Working Party on NAFLD.Guidelines for the assessment and management of nonalcoholic fatty liver disease in the Asia-Pacific region:executive summary[J].JGastroenterol Hepatol,2007,22(6):775-777.

[4] BELLENTANI S,SCAGLIONI F,MARINO M,et al. Epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease[J].Dig Dis,2010,28(1):155-161.

[5] 謝杏榕,譚華炳,胡小林,等.不同程度非酒精性脂肪性肝病兔的血糖變化[J].中國老年學雜志,2011,31(2): 636-637.

[6] 譚華炳,李金科,胡波,等.非酒精性脂肪性肝病兔胰島素水平變化及其機理探討[J].西南國防醫藥,2010,20 (9):937-939.

[7] 譚華炳,賀琴.脂肪肝與血液流變學、C反應蛋白異常的關系[J].中國老年學雜志,2009,29(13):1662-1664.

[8] 葛均波,徐永健.內科學[M].8版.北京:人民衛生出版社,2013:408-411.

[9] 賀琴,雷飛飛,李儒貴,等.絞股藍皂苷降低2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病大鼠血糖、血脂的機理研究[J].湖北醫藥學院學報,2013,32(1):39-43,封3.

[10] 閔懷臻,賀琴,李金科,等.絞股藍皂苷對2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織NF-αmRNA表達和血硫化氫的影響[J].湖北醫藥學院學報,2013,32(4): 317-324.

[11] 譚華炳,雷飛飛,李敬會,等.絞股藍皂苷對2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病大鼠過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達影響[J].遼寧中醫雜志,2013,40(8):1706-1708,封3.

[12] 王戰建,張耀,宋慶芳,等.二甲雙胍對高糖高脂飲食誘導的糖尿病大鼠脂肪肝治療作用的研究[J].中國實用內科雜志,2006,26(20):1603-1605.

[13] 殷霞,成興波.2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝患者血清鐵蛋白水平與氧化應激、胰島素抵抗的關系[J].江蘇醫藥,2013,39(9):1072-1074.

[14] 彭繼升,楊晉翔,高彥彬,等.降濁化瘀合劑對2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠的肝臟保護作用[J].中國中醫基礎醫學雜志,2013,19(8):895-897,901.

[15] 孔銀,張嶺漪.瘦素及脂聯素與非酒精性脂肪性肝病[J].臨床肝膽病雜志,2011,27(4):441-443.

[16] 魏媛媛,閆冬,阿以仙木·加帕爾,等.石榴花多酚對糖尿病合并脂肪肝大鼠肝臟中PON表達的影響[J].藥學學報,2013,48(1):71-76.

[17] 張娟,路金才.皂甙的提取方法及含量測定研究進展[J].中國現代中藥,2006,8(3):25-28.

[18] NORBERG A,HOA N K,LIEPINSH E,et al.A novel insulin-releasing substance,phanoside,from the plantGynostemma pentaphyllum[J].J Biol Chem,2004,279 (40):41361-41367.

[19] XU JQ,SHEN Q,LIJ,etal.Dammaranes fromGynostemma pentaphyllumand synthesis of their derivatives as inhibitors of protein tyrosine phosphatase1B[J].Bioorg Med Chem, 2010,18(11):3934-3939.

[20] 趙世印,邱華,賀琴,等.絞股藍皂苷對2型糖尿病并NAFLD大鼠肝纖維化影響[J].醫藥導報,2014,33(2): 156-159.

DOI 10.3870/yydb.2014.12.003

Effect of Gypenosides on Lipid Peroxidation in Rats with Type 2 Diabetes Mellitus Complicated by Nonalcoholic Fatty Liver Disease

HE Qin1,2,LI Fang1,TAN Hua-bing1
(1.Department of Infectious Disease,Laboratory of Liver Disease;2. Department of Pharmacy,Renmin Hospital,Hubei University ofMedicine,Shiyan 442000,China)

Objective To observe the effect of gypenoside on lipid peroxidation and hepatic lesion in rats with type 2 diabetesmellitus and nonalcohol fatty liver disease.MethodsTotally,65 SPFmale SD rats were randomly divided into blank control group(group N),NAFLD model group(group NM),and NAFLD with T2DM model group.The NAFLD with T2DM model group was further divided into three subgroups:JH group,perfused with 1 g·kg-1·d-1GPS;JL group,perfused with 0.5 g·kg-1·d-1GPS;model control group,perfused with the same volume ofwater.Blood sugar,triglycerides(TG),total cholesterol (TC),alanine aminotransferase(ALT),aspart aminotransferase(AST),adeponectin(ADP)in the plasma weremeasured.TG, malondialdehyde(MDA),and superoxide dismutase(SOD)in the liver tissue were also tested.ResultsADP level was (7.46±1.12),(3.58±0.98),(4.89±1.02),(4.79±1.01)and(4.13±0.89)ng·mL-1in N,M,NM,JH and JL groups, respectively.The ADP levelwas significantly higher in group JH and JL than in group M(P＜0.01),and significantly higher in group JH than in group JL(P＜0.05).MDA level was(2.98±0.09),(4.22±0.11),(3.66±0.10),(3.72±0.11),(3.99± 0.13)nmol·mL-1in N,M,NM,JH and JL groups,respectively.The MDA levelwas significantly lower in group JH and JL than in group M(P＜0.01),and significantly lower in group JH than in group JL(P＜0.05).SOD level was(240.8±17.4), (149.9±20.6),(181.6±19.4),(209.8±19.2),(189.4±18.9)U·mL-1in N,M,NM,JH,and JL groups,respectively.SOD level was significantly higher in group JH and JL than in group M(P＜0.01),and significantly higher in group JH than in group JL(P＜0.05).TG level was(28.98±1.68),(214.46±5.44),(198.46±6.98),(142.87±6.64)and(164.92±7.56) mg·g-1in N,M,NM,JH and JL groups,respectively.TG levelwas significantly lower in group JH and JL than in group M(P＜0.01),and significantly lower in group JH than in group JL(P＜0.05).ALT and AST were significantly lower in group JH and JL than in group M(P＜0.01),and significantly lower in group JH than in group JL(P＜0.05).ConclusionThe lipid peroxidation in the liver of rats with T2DM complicated with NAFLD can be reduced by gypenoside,and hepatic lesion may be alleviated through inhibition of lipid peroxidation.

Gypenosides;Diabetesmellitus,type 2;Liver disease,fatty,nonalcoholic;Lipid peroxidation;Hepatic lesion

R285.5;R587.1

A

1004-0781(2014)12-1549-05

2014-02-27

2014-05-19

*湖北省衛生廳2009年科研項目(JX4B59)

賀琴(1964-),女,湖北房縣人,副主任藥師,從事中藥臨床教學科研工作。電話:(0)15971892342,E-mail: renmthb@163.com。

譚華炳(1963-),男,湖北房縣人,主任醫師,教授,研究生導師,從事感染性疾病(肝病)臨床教學科研工作。電話:(0)13707287512,E-mail:renm thb@163.com。