金釵石斛水煎劑對糖尿病腎病大鼠腎臟PPARγ表達的影響*

劉園園,張艷磊,何曉然,李小瓊,唐彥萍

(遵義醫學院生物化學教研室,遵義 563003)

金釵石斛水煎劑對糖尿病腎病大鼠腎臟PPARγ表達的影響*

劉園園,張艷磊,何曉然,李小瓊,唐彥萍

(遵義醫學院生物化學教研室,遵義 563003)

目的 通過觀察金釵石斛水煎劑對糖尿病腎病(DN)大鼠腎皮質過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)表達的影響,探討其對DN的保護作用及相關機制。方法將60只健康SD大鼠隨機分為6組,每組10只:正常對照組(NC組),模型對照組(DN組),羅格列酮組(RGZ組),金釵石斛小劑量(LD)、中劑量(MD)、大劑量(HD)干預組。在大鼠糖尿病造模成功后各組分別給藥12周,觀察大鼠腎臟病理、Real-time PCR法檢測大鼠腎皮質PPARγmRNA表達、Western blot法檢測大鼠腎皮質中PPARγ蛋白表達的情況。結果金釵石斛水煎劑能明顯改善糖尿病大鼠腎臟基底膜增厚及足突增粗融合;增加DN大鼠腎皮質中PPARγmRNA及蛋白的表達(P＜0.05或P＜0.01)。結論金釵石斛水煎劑可以減輕DN大鼠的腎損傷,其機制可能與上調DN大鼠腎皮質中PPARγ表達有關。

金釵石斛水煎劑;腎病,糖尿病;過氧化物酶體增殖物激活受體γ

金釵石斛是一種名貴中藥材,具有降血糖、抗氧化、抗腫瘤、調節免疫等藥理作用。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)是核受體轉錄因子超家族成員之一,其主要分布在腎臟髓質集合管,腎臟其他部位也有少量分布[1]。近期研究發現,上調PPARγ表達可以減輕糖尿病腎臟損傷[2]。PPARγ激動藥羅格列酮是胰島素增敏劑,研究發現它能改善胰島素抵抗、降低血糖[1]。筆者采用鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導大鼠糖尿病腎病模型,用不同濃度金釵石斛水煎劑干預,觀察金釵石斛水煎劑對糖尿病腎病大鼠腎皮質PPARγ基因表達影響。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley, SD)大鼠,體質量180～200 g,第三軍醫大動物實驗中心提供,合格證號:SCXK(渝)2007-0005。大鼠分籠飼養于日照12 h,室溫18～25℃,相對濕度45%～55%,通風良好的環境中,進食普通顆粒飼料,自由飲水。

1.2 藥品與試劑 金釵石斛(遵義赤水金釵石斛基地提供,經貴陽中醫學院王世清教授和本院藥學系楊建文教授鑒定),馬來酸羅格列酮(天津葛蘭素史克公司,批準文號:國藥準字H20020475,批號:10125188),STZ(美國Sigma公司,批號:S0130),大鼠胱抑素C(cystatin C, CysC)酶聯免疫試劑盒,大鼠β2-微球蛋白(β2-MG)酶聯免疫試劑盒(美國R&D公司),兔抗大鼠PPARγ多克隆抗體(英國Abcam公司),辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(北京博奧生物技術有限公司)。

1.3 儀器 Bio-Rad CFX熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD科技有限公司),Western blot電泳系統(美國BIO-RAD科技有限公司),全自動生化分析儀AU5400(日本貝克曼庫爾特公司)。

1.4 金釵石斛水煎劑的制備 金釵石斛粗粉,分別加入10倍量雙蒸水,煎煮3次,合并3次濾液,用旋轉蒸發儀濃縮為質量濃度相當于生藥2 g·mL-1的浸膏。

1.5 動物模型建立及分組 健康雄性SD大鼠60只,隨機分為正常對照組(NC組,n=10)和糖尿病模型對照組,糖尿病模型對照組給予STZ 60 mg·kg-1,單次腹腔注射。72 h后測血糖,連續3 d血糖≥16.7 mmol·L-1確定為糖尿病大鼠[3]。將成模大鼠隨機分為模型對照組(DN組),羅格列酮組(RGZ組,給予羅格列酮2 mg·kg-1·d-1),金釵石斛小劑量、中劑量、大劑量組(LD、MD、HD組,分別給予相當于金釵石斛生藥5,10, 20 g·kg-1·d-1)。每組10只,每日一次灌胃,連續給藥12周后,檢測6組大鼠血糖、摘取腎臟。

1.6 一般項目檢測 血糖、體質量、酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法檢測糖尿病大鼠血清CysC和尿液中β2-MG含量,尿素氮用全自動生化分析儀AU5400檢測。

1.7 透射電子顯微鏡觀察大鼠腎組織形態學變化 腎皮質切成組織塊1 mm3,經3%戊二醛、1%鋨酸固定,漂洗、脫水,環氧樹脂包埋,切片、染色,電鏡下觀察腎臟超微結構。

1.8 Real-time PCR法檢測各組大鼠腎皮質PPARγ mRNA表達的影響 PPARγ特異性引物Forward:5′-CCTCCCTGATGAATAAAGATGG-3′,Reverse:5′-CACAGCAAACTCAAACTTAGGC-3′,β-actin特異性引物Forward:5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′,Reverse:5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′(上海生物工程公司)。

1.9 Western blot法檢測大鼠腎皮質PPARγ蛋白表達 腎皮質總蛋白經10%聚丙烯凝膠電泳后電轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上, 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,1∶400稀釋一抗,4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,1∶1 000稀釋羊抗兔IgG二抗,室溫孵育1 h,增強化學發光法(enhanced chemiluminescence,ECL)發光、顯影、定影。

2 結果

2.1 飲水量、飲食量、尿量 實驗結束時大鼠存活47只,死亡13只。其中DN組死亡3只,死亡原因考慮為感染、酮癥酸中毒、腸脹氣;RGZ組死亡2只,死亡原因為并發感染;金釵石斛3個劑量組共死亡8只,大鼠大體解剖觀察可見2只爛尾,頸部有囊腫,1只腸脹氣,其余5只未見明顯異常;NC組無死亡。

STZ誘導的糖尿病大鼠明顯出現多飲、多食、多尿等癥狀(P＜0.01);與DN組相比,MD組和HD組飲水量和尿量減少(P＜0.05,P＜0.01);而飲食量,DN組與RGZ組和金釵石斛3個劑量組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 血糖、體質量、腎指數 實驗12周末,STZ誘導糖尿病模型體質量低于NC組(P＜0.01)而血糖和腎指數均高于NC組(P＜0.01);與DN組相比,RGZ組和HD組大鼠血糖降低,體質量增加(P＜0.01),而腎指數在RGZ組和金釵石斛3個劑量組與DN組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表1 6組實驗大鼠飲水量、飲食量和尿量比較Tab.1 Comparison of water intake,food intake and urine volume of in six groups of rats ±s

表1 6組實驗大鼠飲水量、飲食量和尿量比較Tab.1 Comparison of water intake,food intake and urine volume of in six groups of rats ±s

與NC組比較,*1P＜0.01;與DN組比較,*2P＜0.05,*3P＜0.01Compared with group NC,*1P＜0.01;compared with group DN,*2P＜0.05,*3P＜0.01

組別大鼠/只飲水量/ [mL·(24 h)-1]飲食量/ [g·(24 h)-1]尿量/ [mL·(24 h)-1] NC組10 28.30±5.74 22.63±1.77 10.70±1.51 DN組7 200.71±48.05*1 52.66±8.26*1 87.71±10.06*1RGZ組8 108.00±33.87*1*2 42.36±5.21*1 36.38±6.65*1*3LD組8 135.50±27.84*1 49.91±11.23*1 66.75±9.35*1*2MD組7 115.86±30.84*1*2 46.53±8.04*1 40.57±6.80*1*3HD組7 91.71±15.77*1*2 42.04±6.93*1 47.29±9.83*1*3

2.3 血清CysC、尿素氮、β2-MG檢測 糖尿病大鼠血清CysC、尿素氮、β2-MG都高于NC組(P＜0.01);LD、MD、HD組和RGZ組的血清中CysC和尿素氮與DN組差異有統計學意義(P＜0.01);而β2-MG,MD和HD組低于DN組,差異有統計學意義(P＜0.01),HD組與RGZ組差異無統計學意義。見表3。

2.4 電鏡結果 電鏡觀察結果見圖1。如箭頭所示: NC組基底膜結構完整,基底膜厚度均勻一致,無足突增粗融合;STZ誘導的DN組基底膜厚薄不均,腎小球臟層上皮細胞足突增粗、融合、破壞;HD組和RGZ組基底膜厚度均勻一致,無明顯增厚,有部分足突融合。

2.5 Real-time PCR法檢測mRNA的表達 熒光定量PCR結果顯示:與NC組相比,DN組大鼠腎皮質PPARγ mRNA表達量降低(P＜0.01);而RGZ組PPARγmRNA表達量高于DN組(P＜0.01);MD組和HD組可以上調PPARγ表達(P＜0.05或P＜0.01),其中HD組與RGZ組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。見表4。

表2 6組實驗大鼠血糖、體質量、腎指數比較Tab.2 Comparison of blood glucose,body weight and kidney index in six groups of rats ±s

表2 6組實驗大鼠血糖、體質量、腎指數比較Tab.2 Comparison of blood glucose,body weight and kidney index in six groups of rats ±s

與NC組比較,*1P＜0.01;與DN組比較,*2P＜0.01Compared with group NC,*1P＜0.01;compared with group DN,*2P＜0.01

組別大鼠/只血糖/(mmol·L-1)體質量/g腎指數/(×103) NC組10 5.78±0.77 403.21±48.61 1.92±0.27 DN組7 26.91±1.12*1181.83±17.73*17.85±2.31*1RGZ組8 22.63±2.22*1*2252.51±56.72*1*24.29±0.87*1LD組8 26.10±1.57*1201.33±25.09*16.17±1.04*1MD組7 25.64±1.91*1223.79±30.89*15.45±1.01*1HD組7 24.17±2.25*1*2247.14±56.43*1*24.68±1.33*1

表3 6組實驗大鼠血清CysC、尿素氮、β2-MG比較Tab.3 Comparison of the serum level of CysC,urea andβ2-MG in six groups of rats ±s

表3 6組實驗大鼠血清CysC、尿素氮、β2-MG比較Tab.3 Comparison of the serum level of CysC,urea andβ2-MG in six groups of rats ±s

與NC組比較,*1P＜0.01;與DN組比較,*2P＜0.01Compared with group NC,*1P＜0.01;compared with group DN,*2P＜0.01

組別大鼠/只血清CysC/ (μg·L-1)尿素氮/ (mmol·L-1) β2-MG/ (ng·L-1) NC組10 575.75±53.33 9.68±1.19 46.71±4.01 DN組7 911.89±72.45*122.73±3.47*170.25±6.13*1RGZ組8 593.85±74.43*213.28±2.40*1*254.04±2.37*1*2LD組8 676.20±68.84*1*216.34±2.53*1*265.59±3.41*1MD組7 612.44±32.41*213.86±2.71*1*260.86±5.84*1*2HD組7 587.67±65.09*213.32±2.67*1*257.53±5.97*1*2

A.NC組;B.DN組;C.RGZ組;D.HD組圖1 4組實驗大鼠腎臟電鏡觀察結果(×8 900)A.group NC;B.group DN;C.group RGZ;D.group HDFig.1 Renal pathology of four groups of rats by electron m icroscope(×8 900)

2.6 Western blot檢測各組大鼠腎皮質中PPARγ蛋白表達水平 Western blot實驗結果顯示:NC組大鼠腎皮質PPARγ高表達,而DN組表達量降低(P＜0.01),給予金釵石斛水煎劑灌胃12周后,MD組和HD組上調糖尿病大鼠腎皮質中PPARγ蛋白表達量(P＜0.05或P＜0.01),與RGZ組比較組間差異無統計學意義。見表4,圖2。

表4 6組大鼠腎皮質中PPARγm RNA及蛋白表達比較Tab.4 Comparison of PPARγm RNA and protein expression of in renal cortex in six groups of rats ±s

表4 6組大鼠腎皮質中PPARγm RNA及蛋白表達比較Tab.4 Comparison of PPARγm RNA and protein expression of in renal cortex in six groups of rats ±s

與NC組比較,*1P＜0.01,*3P＜0.05;與DN組比較,*2P＜0.01,*4P＜0.05Compared with group NC,*1P＜0.01,*3P＜0.05;compared with group DN,*2P＜0.01,*4P＜0.05

灰度值NC組組別大鼠/只PPARγmRNA (PPARγ/β-actin) PPARγ灰度值/ β-actin 10 1 1.11±0.29 DN組7 0.18±0.09*10.45±0.19*1RGZ組8 1.39±0.69*21.03±0.34*2LD組8 0.34±0.23*10.75±0.30*3MD組7 0.86±0.64*40.92±0.42*4HD組7 0.92±0.49*21.07±0.39*2

圖2 6組大鼠腎皮質PPARγ蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophotogram of PPARγprotein expression in the renal cortex in six groups of rats

3 討論

金釵石斛味甘、微咸、微寒,歸胃、腎經,具有滋陰清熱、潤肺止咳、生津益胃的功效,其有效成分為多糖和生物堿,具有降血糖、抗氧化、抗腫瘤、調節免疫等藥理作用[4]。參與石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛浸膏溶液、石斛清胃散等產品組成,對咽喉疾病、腸胃疾病、白內障、心血管疾病、糖尿病有顯著療效[4]。筆者擬從其對糖尿病的作用研究其作用的分子機制。

本研究發現,STZ誘導的糖尿病組大鼠12周后出現典型的糖尿病癥狀,并且電鏡結果可見腎臟結構出現系膜細胞腫脹,系膜基質增生,基底膜增厚,足突融合等病理改變,表明有糖尿病腎損傷。金釵石斛大劑量組腎臟損傷較輕,僅見部分足突融合。腎功能檢測顯示DN組大鼠血清中CysC、尿素氮和尿中β2-MG含量增加,表明糖尿病大鼠已有腎功能異常。給予金釵石斛干預后,金釵石斛3個劑量組的CysC和尿素氮含量均降低,β2-MG在RGZ組和金釵石斛MD組和HD組含量降低,并且金釵石斛HD組與RGZ組的CysC、尿素氮和β2-MG含量均差異無統計學意義,以上結果說明金釵石斛能夠改善糖尿病大鼠腎功能,其中HD組作用較好。

筆者還觀察到正常大鼠腎皮質中存在PPARγ表達,而STZ誘導的DN組大鼠腎皮質中PPARγmRNA和蛋白表達均降低。本研究各實驗組在模型基礎上分別給藥12周后,Real-time PCR法和Western blot法檢測糖尿病大鼠腎皮質中mRNA和蛋白表達,與DN組大鼠相比,MD組、HD組和RGZ組大鼠腎皮質中PPARγ表達量增高,隨金釵石斛濃度增加,腎皮質中PPARγmRNA及蛋白表達量增高,其中HD組與RGZ組間差異無統計學意義。表明金釵石斛可以改善糖尿病模型大鼠腎臟中PPARγ表達的降低,使其表達量升高,其作用與RGZ組相似,與文獻報道一致[2,5]。

綜上所述,本實驗結果顯示赤水金釵石斛上調糖尿病大鼠腎皮質中PPARγ表達,在一定程度上減輕糖尿病模型大鼠腎臟病理損傷,改善了腎功能。由此推測金釵石斛使PPARγ在腎臟中的高表達可能對維持腎臟功能有一定作用,還可能參與了糖尿病的發展進程,從而達到對腎臟保護作用。本實驗為赤水金釵石斛的開發及應用提供實驗數據。糖尿病腎病發病機制復雜,除了調節PPARγ表達外,是否還存在其他機制有待進一步研究。

[1] 臧會玲,王春炅,楊吉春,等.PPARγ在糖尿病腎病中的保護作用[J].生理科學進展,2010,41(6):435-438.

[2] GAO D,LIQ,GAO Z,et al.Antidiabetic effects ofCorni Fructusextract in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Yonsei Med J,2012,53(4):691-700.

[3] 陶鳳,金徽,楊貴忠,等.金釵石斛水提物對糖尿病大鼠腎組織非酶糖基化及氧化的影響[J].山東大學學報,2012, 50(10):11-15.

[4] 錢桂敏,章華潑.金釵石斛化學成分及藥理作用研究進展[J].中國中醫藥現代遠程教育,2011,9(4):194-196.

[5] BHATT J K,THOMAS S,NANJAN M J,et al.Resveratrol supplementation improves glycemic control in type 2 diabetes mellitus[J].Nutr Res,2012,32(7):537-541.

DOI 10.3870/yydb.2014.12.002

Effect of Dendrobium Nobile Lindl Decoction on Expression of PPARγin Diabetic Nephropathy Rat K idney

LIU Yuan-yuan,ZHANG Yan-lei,HE Xiao-ran,LIXiao-qiong,TANG Yan-ping
(Department of Biochemistry, ZunyiMedical College,Zunyi 563003,China)

Objective To explore the protective mechanism ofDendrobium nobile lindl(DNL)decoction on the expression of peroxisome proliferator activated receptor gamma(PPARγ)in the renal cortex of diabetic nephropathy(DN)rats.MethodsSixty SD ratswere randomly divided into six groups(n=10 per group)as follows:normal control group(NC), diabetic nephropathy controlgroup(DN),rosiglitazone group(RGZ),theDendrobium nobile lindllow(LD),medium(MD)and high(HD)dose groups.After DN rat model was established,the rats were administrated with respective medications for 12 weeks,respectively.The renal pathology of rats was observed.The mRNA and protein expression of PPARγin the renal cortex were detectedviaReal-time PCR and Western blotting,respectively.ResultsHigh dose DNL decoction significantly alleviated thickening of kidney tissue basementmembrane and fusion of foot process inmodel rats.The levels of PPARγmRNA and protein expression in the MD and HD groups were significantly increased as compared with the DN group(P＜0.05,P＜0.01).ConclusionDNL decoction can effectively reduce kidney injury by up-regulating the PPARγmRNA and protein expression in diabetic nephropathy rats.

Dendrobium nobile lindldecoction;Nephropathy,diabetic;Peroxisome proliferator activated receptorγ

R285.5;R587.1

A

1004-0781(2014)12-1545-04

2014-02-12

2014-04-16

*國家自然科學基金資助項目(30960509)

劉園園(1982-),女,黑龍江虎林人,碩士,主要從事藥物分子生物學研究。電話:(0)13704828325,E-mail: liuyuanyuan110@163.com。

唐彥萍(1953-)女,貴州遵義人,教授,主要從事藥物分子生物學研究。電話:0852-8609445,E-mail: tiantian8609445@163.com。