重度子疒間前期患者外周血單個核細胞顆粒酶BmRNA的表達及意義*

魏 軍 李雪玲 孫 羽 鄭澤華

子疒間前期是導致孕產婦和圍產兒死亡的主要原因。由于發病原因不清，一直缺乏有效的治療手段。有研究認為子疒間前期發病與母胎免疫失衡有密切關系[1]。顆粒酶（gran?zym，Gzm）主要由激活的自然殺傷（natural killer，NK）細胞和殺傷性T細胞（cytotoxic Tlymphocyte，CTL）合成，存在于活化的細胞胞漿顆粒中[2]。Gzm是一組同源性的絲氨酸蛋白酶，包括Gzm A、B、K、H等成員，其中GzmB具有天冬氨酸酶的活性，是主要的效應分子，其能迅速引起靶DNA斷裂，參與NK和CTL介導的細胞毒作用，是肌體清除病毒感染靶細胞、腫瘤細胞、同種移植細胞的主要途徑。本研究通過檢測GzmB mRNA在子疒間前期外周血單個核細胞中的表達情況，探討其在子疒間前期發病中的作用，以期為子疒間前期的免疫病因學研究提供新的線索。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2007年12月—2009年6月就診于我院產科的重度子疒間前期孕婦32例（子疒間前期組），參照文獻[3]中的標準進行診斷。孕婦平均年齡（31±4）歲，孕（36±2）周；同時選取年齡及孕周相匹配的健康孕婦32例作為對照組，孕婦平均年齡（31±4）歲，孕（37±1）周。2組孕婦年齡（t=0.487）、孕周（t=0.961）差異無統計學意義（均P>0.05）。且均無原發性高血壓、糖尿病及肝腎疾病等。

1.2 試劑及儀器 GzmB引物（上游：5′-GCCGACCCAG CAGTTTAT-3′，下游：5′-TTCGCACTTTCGATCTTCC-3′，產物長度 274 bp），β-actin（上游：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCAC CA-3′，下游：5′-C T CCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，產物長度498 bp）由Invitrogen公司合成。TRIzol一步法提取總RNA試劑盒、逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒均購自Invitrogen公司。計算機凝膠圖像分析系統為美國Bio-Rad公司產品。

1.3 外周血采集及總RNA提取 采集各組孕婦空腹肘正中靜脈血2 mL，置入EDTA抗凝試管中，分離外周血單個核細胞，PBS洗滌，將獲得的單個核細胞懸浮于PBS中。采用TRIzol一步法提取總RNA，操作按試劑盒操作步驟進行。RNA呈黃白色，沉于試管底。加75%的乙醇洗滌RNA，在真空中干燥。將RNA沉淀溶解于30μL去離子水中，-70℃保存。

1.4 RT-PCR 參照RT-PCR試劑盒說明書進行，反應條件為65℃ 30 min，98℃ 5 min，5℃ 5 min。取2μLRT產物作為模板，置入12.5μL反應體系中，加入目的基因和內參引物進行基因擴增。擴增條件為94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共擴增40個循環。

1.5 PCR表達產物的檢測 取8μL PCR產物加2μL溴酚藍，上樣到質量濃度為2%的瓊脂糖凝膠進行電泳。采用計算機凝膠圖像分析系統，進行拍照、掃描定量，將各表達產物掃描所得數值與同組標準對照物的比值作為評價mRNA表達量的相對指標。

1.7 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，樣本均數比較用t檢驗，相關性分析采用Pearson相關，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組GzmB mRNA表達水平比較 子疒間前期組GzmB mRNA相對表達強度為1.297±0.239，高于對照組的0.792±0.210，差異有統計學意義（t=8.963，P<0.01），見圖1。

2.2 子疒間前期組GzmBmRNA表達水平與平均動脈壓的相關性分析 子疒間前期組孕婦的平均動脈壓為（133±5）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），與GzmBmRNA表達水平呈正相關（r=0.693，P<0.01）。

3 討論

本研究表明，重度子疒間前期患者外周血單個核細胞GzmBmRNA表達水平較正常孕婦升高，與平均動脈壓呈正相關，提示GzmB參與了子疒間前期發病。筆者既往研究發現，子疒間前期重度患者血清中的NK細胞殺傷活性增強[4]，NK細胞與血管內皮細胞黏附增多[5]。其他研究發現NK細胞黏附于血管內皮細胞可引起磷酸肌醇代謝相關的鈣流動[6]，伴隨著鈣-鈣調蛋白激酶Ⅱ的活化，釋放穿孔素和顆粒酶，并分泌干擾素-γ（IFN-γ）。穿孔素能夠在靶細胞表面形成孔道，破壞細胞膜的完整性，而顆粒酶作為一種絲氨酸蛋白酶，由此孔道進入靶細胞，導致DNA裂解，引起血管內皮細胞凋亡及功能改變，進而釋放內皮素等血管活性因子增多，血管平滑肌痙攣，出現血壓升高等臨床癥狀。

Damle等[7]研究發現，活化的NK細胞與血管內皮細胞黏附增強，并在局部產生腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β和IFN-γ等細胞因子。這些細胞因子誘導內皮細胞黏附分子的過表達，這種過表達趨化更多的NK細胞與血管內皮細胞結合，使NK細胞介導的血管內皮細胞損傷呈現惡性循環。對器官移植及腫瘤的相關研究表明，激活的NK細胞緊密黏附于血管內皮細胞，引起內皮細胞功能改變，血管通透性增強，周身水腫,出現血管滲漏綜合征。

在母胎免疫平衡中，正常妊娠表現為Th2優勢，而子疒間前期患者表現為Th1優勢，母體對胎兒生長發育免疫耐受失衡。研究表明子疒間前期患者血清中Th1型細胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ含量明顯高于正常妊娠[8]。而Th2型細胞因子IL-4、IL-10水平下降，Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ能促進NK的活化和增殖，表達更多的GzmB，進而導致殺傷活性增強。

另有研究認為，合體滋養細胞在正常新陳代謝過程中，會釋放一些細胞碎片進入血液循環，被抗原提呈細胞（APC）的Toll樣受體（TLRs）攝取，導致輕微的全身炎癥樣反應[9]。這些促炎因子，尤其是少量IL-18可抑制循環中的NK細胞和NKT細胞IFN-γ的產量，對妊娠體內Th2優勢狀態的維持起重要作用。在子癇前期中合體滋養細胞受損，會釋放過多細胞碎片進入血液循環系統，促炎因子生成增加，加重全身炎癥樣反應[10]，過量的IL-12可誘導NK細胞中GzmB的積聚，從而刺激穿孔素/GzmB介導的NK細胞毒性。

綜上，在子疒間前期中，母胎免疫失衡，GzmB表達增多，其介導的血管內皮細胞凋亡增多，引起廣泛的內皮細胞功能損傷，分泌血管活性物質增多，并使血管通透性增加，出現高血壓、蛋白尿及水腫，進而導致子疒間前期的發病。

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