雞滑液囊支原體的分離鑒定及耐藥性分析

顧的樂(lè)

（新興縣溫氏食品聯(lián)營(yíng)有限公司，廣東 云浮 527400）

由雞滑液支原體（Mycoplasma Synoviae，MS）引起的腿病是雞的一種常見(jiàn)、多發(fā)性傳染病。該病在規(guī)模化雞場(chǎng)中分布廣泛、危害大，主要引起4～16周齡的雞感染發(fā)病，并迅速水平傳播，雞群發(fā)感染后發(fā)育受阻，甚至引發(fā)免疫抑制，容易繼發(fā)或伴發(fā)其它疫病。近年來(lái)，由于環(huán)境因素或雞群不良狀態(tài)等不利因素的影響，該病在免疫雞群中的爆發(fā)現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，對(duì)雞業(yè)養(yǎng)殖生產(chǎn)中控制及預(yù)防帶來(lái)嚴(yán)峻的考驗(yàn)。因此，本研究應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室方法分離廣東地區(qū)疑似MS病原，利用PCR技術(shù)、觀察菌落形態(tài)、病例復(fù)制等方法對(duì)病原進(jìn)行鑒定，并對(duì)MS分離株進(jìn)行敏感藥物的篩選，為臨床有效防控該病提供較為可靠的參考。

一、材料與方法

1 材料

1-1 病料：收集廣東某地區(qū)疑患MS感染雞群的氣管、支氣管、肺、腿關(guān)節(jié)等組織和分泌物。

1-2 雞胚：雞胚 9日齡健康雞胚。

1-3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 10日齡SPF雞。

1-4 試劑： PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自國(guó)外某公司；其它試劑為國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的分析純?cè)噭?/p>

1-5 引物設(shè)計(jì)與合成利用Primer Premier5.0軟件，根據(jù)Genbank中注冊(cè)的MS 16SrRNA片段基因序列，設(shè)計(jì)合成多對(duì)引物，經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選出一對(duì)特異性引物MS-F/MS-R（MS-F：5’-CAGGCCGTCAAGGTCTTGTTC--3’；MSR2：5’- ACCGGCACAGCTATCCTCCTT-3’），跨度500bp。引物由國(guó)內(nèi)一公司合成，引物使用終濃度為20nmoles/mL，-20℃狀態(tài)保存。

2 方法

2-1 雞滑液囊支原體的分離和鑒定

2-1-1 樣品的收集與處理

收集廣東地區(qū)雞群的疑患MS感染雞群的氣管、支氣管、肺、腿關(guān)節(jié)組織和分泌物，加入MS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)數(shù)天，直至培養(yǎng)基變黃。

2-2 雞毒支原體單菌落的挑取

無(wú)菌抽取少量已經(jīng)變黃的培養(yǎng)液進(jìn)行雜菌污染檢查，在確定培養(yǎng)液無(wú)雜菌生長(zhǎng)之后，將變黃可疑培養(yǎng)物在相同的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代3～5 代，然后取0.2mL培養(yǎng)物，接種于支原體固體培養(yǎng)基中，在37℃ 厭氧環(huán)境下培養(yǎng)7～15天。待肉眼可視菌落大小后，置于倒置10×10低倍顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，并用滅菌注射器針頭挑取典型單菌落于2mL 液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)和鑒定。

2-3 雞毒支原體菌落形態(tài)觀察

將分離純化培養(yǎng)的待鑒定的雞毒支原體培養(yǎng)物0.2mL接種于固體培養(yǎng)基中，37℃ 厭氧培養(yǎng)7～10d 后，置于低倍鏡下觀察菌落形態(tài)。

2-4 雞毒支原體姬姆薩染色鏡檢

將純化培養(yǎng)后待檢雞毒支原體培養(yǎng)液5mL，以3000rpm離心10min,用 PBS（pH6.8）按1/20 比例稀釋姬姆薩染色液，染色3h。

2-5 臨床菌株的分子生物學(xué)鑒定

按照愛(ài)思進(jìn)公司的DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取MS的DNA。按照PCR擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明，在24.4μL反應(yīng)體系中，加入 RNAfree 水 16.6μL，5×PCR buffer5μL,酶 0.2μL，cDNA2μL,P1和P2各0.3μL。擴(kuò)增參數(shù)為：經(jīng)過(guò)94℃ 3秒后，94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 30s，循環(huán)30次。再在72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

圖1 a臨床第1株在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天后菌落（10×10）

2-6 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)

病雞關(guān)節(jié)炎滲出物接種于18天齡SPF雞胚卵黃囊，孵育7天后，收集卵黃液，以腳墊注射的方式按0.2ml/只用量，接種10日齡SPF雞，每天觀察并記錄雞只變化情況。

2-7 臨床株對(duì)常用抗菌藥物的敏感性測(cè)定

2-7-1 抗菌藥原液的配制

圖2

根據(jù)藥物的推薦治療量，將各抗菌藥物配制成濃度為128倍治療量的原液。氟喹諾酮類分別用無(wú)菌5%醋酸溶解后，用滅菌去離子水定容；氟苯尼考用無(wú)水乙醇溶解后，用pH6.0滅菌PBS定容；泰樂(lè)菌素用pH6.0滅菌PBS溶解、定容；強(qiáng)力霉素用pH4.5 滅菌PBS溶解、定容；采用細(xì)菌過(guò)濾除菌，分裝，-20oC冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2-7-2 最小抑菌濃度的測(cè)定

首先測(cè)定各株臨床菌的顏色變化單位（CCU），參照Hannan 推薦的標(biāo)準(zhǔn)，臨用前將各菌株稀釋至105。在96孔細(xì)胞板中,第1列每孔加180uL稀釋的菌液，其余各管中加入100uL菌液，將20umL藥液加入每列的第一孔中，充分吹打均勻后，取100uL加入第二管，以此類推，最后吸出100uL菌液棄去。每種藥液做兩個(gè)重復(fù)，最后兩列不加抗生素作空白對(duì)照37oC培養(yǎng)6～10d，每日觀察記錄結(jié)果。以抑制MG生長(zhǎng)的抗生素的最高稀釋度作為最小抑菌濃度。

3 結(jié)果

3-1 臨床雞滑液囊支原體的分離、鑒定

3-1-1 雞滑液囊支原體菌落形態(tài)觀察

分離純化的可疑菌株在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)呈清亮黃色，輕輕振蕩，有沙粒樣菌體懸浮。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10d后，有些菌株用肉眼觀察，可見(jiàn)針尖大小、無(wú)色透明、圓潤(rùn)、邊緣光滑的菌落。置低倍鏡（10×10）下觀察，可見(jiàn)菌落為無(wú)色透明，多數(shù)呈典型的“油煎蛋狀”，即菌落中央厚碩隆起。能觀察到支原體的出芽和裂殖兩種增殖方式。（見(jiàn)圖1）

3-1-2 雞滑液囊支原體姬姆薩染色鏡檢

分離純化后的雞滑液囊支原體經(jīng)姬姆薩染色后，在（100×10）顯微鏡下鏡檢，菌體主要呈現(xiàn)藍(lán)紫色球狀，有少量呈細(xì)短桿狀或弧狀。

3-1-3 分子生物學(xué)鑒定

應(yīng)用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)MS分離株的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出一條為約500bp左右的目的片斷，與設(shè)計(jì)結(jié)果完全相符。（見(jiàn)圖2）

3-1-4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

病雞關(guān)節(jié)炎滲出物接種于18天齡SPF雞胚卵黃囊，孵育7天后，收集卵黃液，以腳墊注射的方式接種10日齡SPF雞（0.2ml/只），每天觀察雞只變化情況。接種后7天左右，雞群出現(xiàn)與MS臨床感染相同的典型臨床癥狀，主要表現(xiàn)為臥地、陂行、關(guān)節(jié)腫脹，解剖可見(jiàn)雞只關(guān)節(jié)內(nèi)有黏液滲出物，部分雞只關(guān)節(jié)內(nèi)有干酪樣滲出物。

3-2 抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 9種抗菌藥物對(duì)7株雞滑液囊支原體的最小抑菌濃度

采用試管二倍稀釋法測(cè)定了常用抗菌藥物對(duì)7株雞滑液支原體的最小抑菌濃度。結(jié)果見(jiàn)表1。

4 討論

4-1 雞滑液囊支原體感染多發(fā)于春夏季、潮濕季節(jié)或衛(wèi)生條件、飼養(yǎng)管理不善，主要侵襲雛雞，特別是肉雛雞，常與新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒等呼吸道病原混合感染引起氣囊炎，有時(shí)可引起全身性感染并導(dǎo)致傳染性滑膜炎，給臨床確診帶來(lái)巨大的困難。

目前MS感染的確診方法主要有電鏡法、分離培養(yǎng)法、分子生物學(xué)方法以及血清學(xué)方法；其中，血清學(xué)方法由于經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)非特異性的交叉反應(yīng)，因而在一定程度上會(huì)影響診斷的準(zhǔn)確性；其次，分離培養(yǎng)法由于支原體對(duì)所需條件要求苛刻，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)并且操作也相當(dāng)?shù)姆彪s。相比之下，PCR法方法顯得快速簡(jiǎn)單，并且其敏感性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前兩種方法，可臨床應(yīng)用于MS感染的早期診斷和檢疫，但技術(shù)條件要求較高，在檢測(cè)時(shí)常由于抑制劑的干擾等因素而可能出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，因此最終確診需要多種檢測(cè)方法聯(lián)合使用。本研究通過(guò)菌落形態(tài)觀察、菌體形態(tài)觀察、PCR診斷、動(dòng)物回歸試驗(yàn)，成功建立了MS分離鑒定方法，并在病料中分離出7株MS臨床株，為后續(xù)研究工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4-2 雞支原體感染在養(yǎng)雞業(yè)中非常普遍，預(yù)防和治療該病主要應(yīng)用抗菌藥物，其中應(yīng)用最為廣泛的藥物是林可霉素、泰樂(lè)菌素、紅霉素、喹諾酮類和氨基糖苷類等藥物，但隨著臨床抗菌藥物的大量使用和不合理使用，導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)，造成治療效果不佳或病情反復(fù)的現(xiàn)象。從本次研究的藥敏結(jié)果可看出，臨床株對(duì)受試的9種抗菌藥物的敏感性不一，各臨床株對(duì)替米考星的敏感性差異最大（4.19倍治療量～67倍治療量），同時(shí)，在同一地區(qū)不同時(shí)間不同養(yǎng)戶分離的毒株對(duì)替米考星的敏感性的差異較顯著，替米考星對(duì)第1分離株的最小抑菌濃度是67倍治療量，而對(duì)第2分離株的最小抑菌濃度是4.19倍治療量，說(shuō)明不同地方的用藥情況不一，同一地區(qū)不同時(shí)間不同養(yǎng)戶的用藥歷史、病情長(zhǎng)短不一，導(dǎo)致各臨床株對(duì)同一種藥物的敏感性差異較大；9種抗菌藥物中，強(qiáng)力霉素對(duì)MS分離株的抑制效果最明顯，最小抑菌濃度均小于1，其次是氧氟沙星和利高霉素，兩種抗菌藥物對(duì)MS的抑制效果均較為理想，因此，在臨床上可嘗試參考用該類藥物進(jìn)行防控MS感染。

[1] 雞滑液囊支原體的分離與鑒定[J].中國(guó)家禽，1998.