化學發光分析法測定沙拉沙星的研究

蔣清民，張可擎，王軍

(1.河南化工職業學院應用化學系，河南鄭州 450042;2.陜西省石油化工研究設計院質檢中心，陜西西安 710054)

沙拉沙星(Sarafloxacin)是繼恩諾沙星之后的又一新的動物專用藥，抗菌活性強于雙氟沙星、諾氟沙星、氧氟沙星-丁胺卡那霉素及妥布霉素等，對厭氧菌的抗菌活性與環丙沙星相當。沙拉沙星的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)［1］、分子熒光光度法［2］與紫外可見分光光度法［3］等。沙拉沙星分子結構中含有α-酮酸基團，可與Tb3+配位而產生分子內能量轉移，發射熒光。據此，王磊等［4］測定了鹽酸沙拉沙星注射液中沙拉沙星的含量。研究發現，Tb3+對 Ce4+-H2SO3-Sarafloxacin化學發光體系有很強的增敏作用，據此建立了流動注射-化學發光法測定沙拉沙星的新方法，此法具有靈敏度高、選擇性高等優點。不需任何預處理，適當稀釋就可直接測定沙星注射液中沙拉沙星的含量，回收率為95.1% ～101.4%，并與國標方法進行了對照，結果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

鹽酸沙拉沙星注射液;沙拉沙星對照品(河南省藥品食品檢驗鑒定所提供，純度 ＞99.0%);TbCl3、Ce(NH4)2(NO3)6均為分析純;實驗所用水為石英亞沸重蒸水。

IFFM-D流動注射化學發光儀。

1.2 溶液配制

1.2.1 鋱儲備液(10 mmol/L)配制 稱取3.73 g TbCl3，溶于三次水，定容至100 mL。

1.2.2 Ce4+溶液(10 mmol/L)配制 稱取 5.48 g Ce(NH4)2(NO3)6，溶于水，定容至 100 mL。

1.3 實驗方法

各溶液流路如圖1所示，采用流動注射技術，首先將沙拉沙星標準溶液或樣品溶液與H2SO3溶液混合注入進樣閥，然后以Ce4+與Tb3+混合液為載流，將樣品混合液載入流通池中發生化學發光反應，記錄信號，以峰高定量。

圖1 流動注射化學發光分析儀流路圖Fig.1 Schematic diagram of flow injection chemiluminescence analysisV.注射閥;P.泵;C.流通池;PMT.光電倍增管;AMP.放大器;R.記錄儀;HV.負高壓;W.廢液;a.樣品溶液;b.H2SO3溶液(0.8 mmol/L);c.Ce4+溶液 (0.1 mmol/L);d.Tb3+溶液(0.7 mmol/L)

2 結果與討論

2.1 流路參數的選擇

沙拉沙星、H2SO3、Tb3+和Ce4+4種溶液的進樣方式見圖1，流速與管道長度對發光強度影響見圖2。

圖2 流速和管道長度對發光強度的影響Fig.2 Effect of flow rate and pipe length on chemiluminescence intensity

由圖2可知，各溶液的流速均為3.8 mL/min，并且流通反應池與樣品混合池之間管道長度為20 cm時，發光體系的信噪比最大。

2.2 酸度條件的影響

Ce4+化學發光體系的反應介質多為酸性介質。本文實驗了 HCl、H3PO4、HNO3和 H2SO4等 4種酸對發光強度的影響，結果見圖3。

圖3 酸濃度對發光強度的影響Fig.3 Effect of acid concentration on chemiluminescence intensity

由圖3可知，H2SO4作為反應介質濃度為1.5 mmol/L時發光強度最大，所以，選擇反應介質硫酸的濃度為1.5 mmol/L。

2.3 Ce4+及H2SO3溶液濃度的選擇

在Tb3+-Ce4+-H2SO3-Sarafloxacin的化學發光反應體系中，通過Ce4+氧化H2SO3而產生化學發光，其濃度對體系發光強度的影響，見圖4。

圖4 Ce4+和H2SO3濃度對發光強度的影響Fig.4 Effect of Ce4+and H2SO3concentration on chemiluminescence intensity

由圖4可知，當Ce4+和H2SO3兩種溶液的濃度分別為0.12 mmol/L和1.0 mmol/L時，體系具有最大的發光強度。

2.4 增敏劑及其濃度的選擇

Ce4+-H2SO3發光體系的發光強度很弱，Ce4+-H2SO3-Sarafloxacin體系的化學發光強度也較弱，可加入增敏劑使發光強度增強。實驗了Tb3+、Eu3+、羅丹明B、羅丹明6G、熒光素、二氯代熒光素等對Ce4+-H2SO3-Sarafloxacin體系發光強度的增敏效果。結果發現，Tb3+效果最好，可使其發光強度增加110倍左右，發光信號隨Tb3+溶液濃度的增大而增強，結果見圖5。

圖5 Tb3+濃度對發光強度的影響Fig.5 Effect of Tb3+concentration on chemiluminescence intensity

由圖5可知，當Tb3+溶液濃度為0.85 mmol/L時，發光信號已足夠大。因此，本實驗選擇濃度為0.85 mmol/L 的 Tb3+作 Ce4+-H2SO3-Sarafloxacin發光體系的增敏劑。

2.5 校準曲線、精密度與檢出限

在最佳實驗條件下，發光強度與沙拉沙星濃度呈良好的線性關系，其線性范圍為1.5×10－8～5.0×10－4g/mL。為了提高測定的精密度與準確度，校準曲線按沙拉沙星的濃度范圍進行分段繪制，其基本參數見表1。

圖6 沙拉沙星測定線性曲線Fig.6 Linear curve of Sarafloxacin

表1 校準曲線線性范圍及回歸方程Table 1 Linear range and regression equations of calibration curve

對濃度為2.5×10－5g/mL的沙拉沙星進行11次平行測定，相對標準偏差為2.2%，檢出限為8.3 ng/mL。

2.6 干擾實驗

實驗了沙拉沙星樣品中可能共存組分對測定的干擾情況，結果表明，對于濃度為2.5×10－5g/mL的沙拉沙星溶液，以誤差不大于 ±5% 為限，K+、Na+沒有干擾;1 100 倍的 Zn2+、Ba2+、Ca2+、淀粉、硬脂酸鎂，300 倍的 Co2+、Pb2+、Ni2+、Cu2+，對實驗無干擾，抗壞血酸等還原性較強的物質干擾測定，與其結構相似的氟喹諾酮類藥物，例如司帕沙星、諾氟沙星、蘆氟沙星等均有嚴重干擾。

2.7 回收率及樣品測定

取不同批次沙拉沙星注射液各1支，分別準確量取1 mL樣品(約相當于沙拉沙星 0.1 g)于1 000 mL容量瓶中，定容。取上述溶液適量于25 mL容量瓶中，加入適量系列濃度對照品溶液，定容，結果見表2。

表2 沙拉沙星注射液含量測定結果Table 2 Determination results of Sarafloxacin in injection

由表2可知，本法測定的回收率在97.6% ～101.2%，符合測定要求，適用于沙拉沙星的測定。

3 結論

利用Tb3+能大大增強Ce4+-H2SO3-Sarafloxacin體系化學發光的現象，可實現對沙拉沙星的測定。最佳實驗條件為:1.5 mmol/L硫酸作為反應介質，Ce4+濃 度 為 0.12 mmol/L，H2SO3濃 度 為1.0 mmol/L，增敏劑 Tb3+濃度為0.85 mmol/L，此時體系發光強度最大，方法檢出限為8.3 ng/mL，相對標準偏差為 2.2%，加標回收率為 97.6% ～101.2%，測定選擇性較好，但還原性物質如抗壞血酸和結構類似的喹諾酮類藥物會對測定帶來干擾。因此，對于復雜藥物的分析需要與分離效果較好的色譜技術聯用，這樣才能得到理想的測定結果。

［1］李海迪，楊先樂，胡鯤，等.高效液相色譜法測定中華絨螯蟹主要組織中雙氟沙星及其代謝產物沙拉沙星方法［J］.藥物分析雜志，2009，29(7):1142-1147.

［2］葉鹿鳴，謝東華.高效液相色譜熒光檢測法測定牛奶中3種氟喹諾酮殘留研究［J］.中國衛生檢驗雜志，2008，18(5):804-806.

［3］傅麗，陳金鳳，龍運前，等.膠束增敏熒光法測定鹽酸沙拉沙星［J］.分析試驗室，2008，27(11):95-97.

［4］陳玉海，趙風利，張彥青，等.鋱-沙拉沙星熒光光度法測定沙拉沙星含量［J］.分析試驗室，2009，28(6):24-26.