直接皂化法制備葉綠素銅鈉鹽

韓敏

(西安文理學院化學與化學工程學院，陜西西安 710065)

葉綠素屬于卟啉類化合物［1］，是重要的天然色素，廣泛存在于植物和某些動物體內，常作為著色劑或添加劑應用于醫藥、食品、日用化工等領域［2-4］。我國養蠶歷史悠久，是世界蠶業的發源地和主產國［5-6］，而且研究表明，蠶沙中葉綠素的質量分數約為0.8% ～1.0%，高于綠色植物中的含量［7］。但由于葉綠素的穩定性差，故將葉綠素合成其衍生物，如葉綠素鐵鈉鹽［8］、葉綠素鋅鈉鹽［9］、葉綠素銅鈉鹽［10］等。

葉綠素銅鈉鹽是一種略帶胺味的墨綠色結晶性粉末，具有光亮的色澤、無毒、穩定性良好的特點，且營養價值高，在食品和日用化工中有很廣泛的運用。

傳統葉綠素銅鈉鹽的制備是先用有機溶劑提取葉綠素然后濃縮再皂化［11］，工藝路線較長，成本高。本研究將葉綠素的提取與皂化合并，研究了直接皂化法制備葉綠素銅鈉鹽的最佳工藝條件，并與傳統的工藝作了比較。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

蠶沙，陜西安康旬陽;95%乙醇、氫氧化鈉、石油醚、硫酸、硫酸亞銅、無水乙醇均為分析純。

KQ5200DE型數控超聲波清洗器;7230G型可見分光光度計;R201L型旋轉蒸發儀;IS50型傅里葉紅外光譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將市售的蠶沙于40～50℃烘干后，用粉碎機粉碎后備用。

1.2.2 葉綠素直接提取皂化、濃縮 稱取干蠶沙粉10 g，于250 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水，軟化20 min。加入95%乙醇100 mL，并用10%NaOH調節體系pH值為12，放在超聲波清洗器中，在70℃超聲處理2 h。冷卻至室溫，取樣分析。提取皂化反應后，把溶液減壓濃縮，回收溶劑乙醇。

1.2.3 萃取除雜 將濃縮后的溶液倒入分液漏斗中，加入1∶1的石油醚，進行萃取除雜，然后將墨綠色的皂化液轉入三口燒瓶中，棄去上層雜質。多萃取幾次，回收萃取劑石油醚。

1.2.4 酸化置銅 將萃取液用6 mol/L H2SO4調節 pH2～3，60 ℃酸化30 min，加入10%CuSO4溶液6 mL反應120 min，使葉綠素銅酸顆粒充分析出。過濾，依次用30℃蒸餾水和30%乙醇溶液洗滌，直至濾液呈中性為止。濾餅在60℃烘干得到純凈的葉綠素銅酸。

1.2.5 成鹽 用丙酮將純凈的葉綠素銅酸溶解，用10%NaOH-CH3CH2OH調節溶液pH≈12使葉綠素銅酸成鹽析出，在60℃下烘干，得到具有光亮的色澤、無毒、穩定性良好的葉綠素銅鈉鹽。

1.3 葉綠素含量的測定

吸取0.45 mL用石油醚萃取后的溶液于10 mL容量瓶中，加入95%乙醇至刻度線，在649 nm和665 nm處測定其吸光度值。計算公式如下［11］:

葉綠素 a濃度 Ca=13.97A665－6.89A649

葉綠素 b 濃度 Cb=24.95A649－7.30A665

葉綠素總濃度C總=Ca+Cb

葉綠素提取率=C總×V溶液×稀釋倍數/M樣品

2 結果與討論

2.1 體系pH對葉綠素含量的影響

反應條件同1.2節，結果見圖1。

圖1 體系pH對葉綠素含量的影響Fig.1 The influence of the system of pH on the chlorophyll content

由圖1可知，當pH≈12時，葉綠素的含量趨于穩定，繼續增加堿的用量，葉綠素含量不再降低。所以，應將體系pH值維持在12左右。

2.2 超聲時間對葉綠素含量的影響

反應條件同1.2節，結果見圖2。

由圖2可知，隨著時間的延長，葉綠素含量降低較快，≥120 min時，葉綠素含量降低趨于平緩。原因可能是:①皂化反應本身就是一個可逆反應，在某一時間會達到平衡狀態;②葉綠素在溫度比較高的條件下會分解，在120～180 min，葉綠素的緩慢降低是由于葉綠素被氧化分解變性了。所以，超聲時間應控制在120 min。

圖2 超聲時間對葉綠素含量的影響Fig.2 The influence of ultrasonic time on the chlorophyll content

2.3 超聲溫度對葉綠素含量的影響

反應條件同1.2節，結果見圖3。

圖3 超聲溫度對葉綠素含量的影響Fig.3 The influence of ultrasonic temperature on the chlorophyll content

由圖3可知，超聲溫度在70℃以上時，皂化液中的葉綠素降低趨于平緩。原因可能是:溫度升高，動態反應平衡向右移動，而70℃時反應達到動態平衡，此時繼續增加溫度，產品得率增加平緩，而且還會使葉綠素降解。因此，超聲溫度以70℃為宜。

2.4 加銅量對產品產量的影響

反應條件同1.2節，結果見圖4。

圖4 加銅量對產品產量的影響Fig.4 The influence of dosage of copper on the product production

由圖4可知，隨著10%CuSO4溶液量的增加，葉綠素銅鈉鹽的產量也在增加，當10%CuSO4增加到6 mL時，葉綠素銅鈉鹽的產量增長幅度變得的很小，如果繼續加入10%CuSO4溶液，不僅增加成本，而且還對后期污水的處理增加工作量。所以，加入10%CuSO4溶液為6 mL。

2.5 置銅時間對產品產量的影響

反應條件同1.2節，結果見圖5。

圖5 置銅時間對產品產量的影響Fig.5 The influence of time on the product production

由圖5可知，延長反應時間可以有效地增加產品的產量，但120 min后，產量快速降低。因此，選擇置銅時間為120 min。

2.6 置銅溫度對產品產量的影響

反應條件同1.2節，結果見圖6。

圖6 置銅溫度對產品產量的影響Fig.6 The influence of temperature on the product production

由圖6可知，升高溫度，可以有效地增加產品的產量，但65℃以上時繼續升高溫度，葉綠素銅鈉鹽的產量反而降低。原因可能是:①隨著溫度的升高溶劑的揮發，會使生成的葉綠素銅酸的濃度也增大，該置銅反應是一個可逆反應，產物濃度增大會使反應逆向進行，從而使已經生成的葉綠素銅酸又被分解;②葉綠素銅酸的溶解度隨著溫度的升高而增大，溫度過高不能使葉綠素銅酸完全析出來，而是溶解在溶液里。所以，綜合考慮選取65℃為酸化置銅最優溫度。

2.7 正交實驗結果

選取pH值、超聲溫度、置銅時間和加銅量，采用4因素3水平進行。正交實驗因素和水平見表1，結果見表2

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

表2 正交實驗結果Table 2 Results of the orthogonal test

由表2可知，影響葉綠素銅鈉鹽制備諸因素的主次關系為:體系pH＞置銅時間＞置銅量＞超聲溫度。制備葉綠素銅鈉鹽的最優條件為A2B3C3D2，加堿使皂化體系pH≈12，置銅時間為150 min，置銅量為6 mL，超聲溫度為80℃。

2.8 對照實驗結果

2.8.1 傳統制備法 稱取干蠶沙粉10 g于250 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水軟化20 min。加入95%乙醇100 mL，放置在超聲波清洗器中，在70℃下超聲時間120 min。將提取液轉入250 mL三口燒瓶中，用10%NaOH調節pH≈12，水浴溫度為70℃，皂化120 min。用 6 mol/L H2SO4調節 pH 2～3，65℃下酸化30 min，加入6 mL 10%CuSO4溶液，置銅時間150 min。最后用10%NaOH-CH3CH2OH調節溶液，使葉綠素銅酸成鹽析出。

2.8.2 直接皂化法 稱取干蠶沙粉10 g于250 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水軟化20 min。加入95%乙醇100 mL，并用10%NaOH調節pH≈12，放置在超聲波清洗器中，在70℃下超聲時間120 min。用等量石油醚萃取3次，萃取液轉入250 mL三口燒瓶中，用6 mol/L H2SO4調節 pH 2～3，65℃下酸化30 min。加入 6 mL 10%CuSO4溶液，置銅時間150 min。用10%NaOH-CH3CH2OH調節溶液，使葉綠素銅酸成鹽析出，實驗結果見表3。

表3 對照實驗結果Table 3 Results of the comparison experiment

由表3可知，直接皂化法葉綠素銅鈉鹽的得率大于傳統制備法葉綠素銅鈉鹽的得率，而且比傳統制備法少一道工序，因此直接皂化法是可行的。

2.9 產品分析

2.9.1 產品性狀 制備的葉綠素銅鈉鹽是一種略帶胺味的墨綠色結晶性粉末，具有光亮的色澤、無毒、穩定性良好的特點，極易溶于水，呈透明鮮綠色;微溶于CH3CH2OH和氯仿，幾乎不溶于石油醚和無水乙醚。

2.9.2 紫外-可見光譜(UV-Vis)分析 見圖7。

圖7 葉綠素銅鈉鹽的UV-Vis譜圖Fig.7 UV-Vis spectrum of the copper sodium chlorophyll

由圖7可知，產品的最大吸收波長為413 nm和628 nm，與從竹葉中提取的葉綠素銅鈉鹽［12］的最大吸收波長基本上一致。

2.9.3 紅外光譜(FTIR)分析 見圖8。

圖8 葉綠素銅鈉鹽的FTIR譜圖Fig.8 FTIR spectrum of the copper sodium chlorophyll

3 結論

以蠶沙為原料，采用直接皂化法制備葉綠素銅鈉鹽的最優工藝參數為:10 g干蠶沙粉先在pH 12的體系中，80℃下超聲120 min;再于pH 2～3的體系中，65℃下酸化30 min，加入6 mL 10%CuSO4溶液，置銅150 min，最后用10%NaOH-CH3CH2OH調節溶液使葉綠素銅酸成鹽析出。在此條件下，葉綠素銅鈉鹽的產率為2.12%，比傳統制備法要高。

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