亞油酸去氧氟尿苷酯的合成與表征

馬令利，戴兆云，張芳，彭子飛

(1.上海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234;2.復旦大學附屬華東醫院，上海 200040)

亞油酸(LA)是含有雙鍵的十八碳二烯，作為機體最重要的必須脂肪酸，亞油酸具有人體維生素地位［1］。它的靶向肝癌作用可能性較大，把具有抗癌活性的化合物結合上去，可構建亞油酸抗癌藥物靶向治療體系。亞油酸作為抗癌藥物靶向的載體，與具有相對肝癌選擇性的單克隆抗體、某些親肝癌蛋白質(轉鐵蛋白)［2］、脂質體、納米材料、特異胞膜受體抑制劑等其他靶向制劑載體［3］相比，化學結構較為簡單，不易受到破壞，半衰期較長，而且無免疫原性和蛋白抗原性，生物相容性良好，適合面廣等優點［4］。因此，亞油酸作為肝癌靶向制劑載體，為腫瘤靶向藥物的創制開拓了新思路。

去氧氟尿苷是5-氟尿嘧啶的衍生物，屬抗代謝類抗腫瘤藥［5］。它作為胸腺嘧啶合成酶等的抑制劑，可抑制腫瘤細胞DNA的生物合成，體內體外均證實該藥物可導致腫瘤細胞死亡或凋亡［6-7］。由于其療效確鑿、抗瘤譜廣，所以近50年來，一直是臨床應用中高效抗癌藥物，目前已有多種烷基酯的去氧氟脲苷前藥［8-9］，并且已經證實對癌細胞有很好的選擇性［10］。但去氧氟尿苷熔點高，脂溶性和水溶性都很差，限制了它的實際應用范圍。而去氧氟尿苷的羥基是重要活性基團，可與脂肪酸形成脂肪酸醇酯，將亞油酸與氟脲苷上戊糖的第5位或第3位游離羥基縮合為酯，合成亞油酸去氧氟尿苷酯的共價化合物，預計該化合物可在有關酯酶的催化作用下，緩慢釋放氟脲苷，長期抑制腫瘤生長。本文闡述了亞油酸去氧氟尿苷酯的合成方法，并用1H NMR及LCMS表征。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

亞油酸(99%);去氧氟脲苷;DMAP、DCC、NaHCO3、飽和食鹽水、無水硫酸鎂、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷均是分析純。

AM-500型核磁共振儀(CDCl3作為溶劑，SiMe4作為內部標準);黃海GF254薄層色譜板;6410B高效液相色譜三重四級桿質譜聯用儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 酯化反應 在25 mL圓底燒瓶中加入一定量亞油酸與去氧氟尿苷，使之溶于8 mL干燥后的溶劑二氯甲烷中，形成摩爾比為1∶1.2反應底物，并加入等摩爾比DMAP，通入氮氣保護，在室溫下磁力攪拌10 min，加入等摩爾比DCC，室溫下反應一定時間后，取樣用于產物分析。

將產物過濾，去除白色沉淀物。濾液進行稀釋，過濾掉稀釋后產生的沉淀 DCU。將濾液用飽和NaHCO3水溶液洗滌3次，再用飽和食鹽水洗滌3次，用無水硫酸鎂干燥1 h后過濾。濾液減壓蒸餾除去溶劑得到粘稠狀液體。用二氯甲烷稀釋后作薄層色譜分析。

1.2.2 薄層層析法分析 用點樣毛細管(0.5 mm)取反應稀釋液在預制的硅膠薄層板上點樣，同時以去氧氟尿苷、亞油酸兩種原料為對照，展開劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1，顯色劑為碘蒸氣。

在紫外燈下刮下有產物的硅膠，用二氯甲烷洗出，抽濾，濾液用旋轉蒸發儀蒸去二氯甲烷溶劑，殘留物待測定。

1.2.3 硅膠柱層析分離產物 硅膠柱層析條件:洗脫劑為 V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1，流速為1滴/s，收集洗脫液，并隨時用薄層色譜法檢測產物。收集到的目標產物減壓蒸餾，得到粘稠狀液體。

1.3 液相色譜-質譜聯用分析條件

1.3.1 液相部分 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，柱溫 22 ℃;流動相為甲醇/水，流動相梯度為2 min，甲醇50%;20 min，甲醇95%;流速 0.8 mL/min;進樣量 10 μL。

1.3.2 質譜部分 干燥氣溫度350℃，干燥氣流量6.0 L/min，霧化器壓力20 psi，毛細管電壓350 V(+);采集方式為SIM。

2 結果與討論

2.1 薄層層析分析

通過多次實驗，根據溶劑洗脫順序，選擇了V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=3∶1展開劑系統，分析結果見圖1。

圖1 反應混合物分析Fig.1 The analysis of mixture

由圖1可知，與原料相比，反應液在薄層層析板上部有新的物質出現，初步判定此物質為目標產物。不同成分的 Rf值:Rf1=0.15，Rf2=0.40，Rf3=0.72，Rf4=0.83。根據Rf值可進行硅膠柱層析。

2.2 硅膠柱層析分析

將薄層色譜條件轉至硅膠柱層析分離。硅膠柱層析分離得到的目標產物的TLC分析見圖2。

圖2 目標產物分析Fig.2 The analysis of target product

由圖2可知，經過硅膠柱分離后，薄層層析板上只有一種新物質出現。由此可知，硅膠柱層析分離可以得到較為純凈的目標產物。

2.3 核磁共振波譜分析

目標產物的1H NMR見圖3。

圖3 目標產物的氫譜分析Fig.3 1H NMR of target product

1H NMR(500 MHz，CDCl3，δ):7.41(d，1H，J=6.5 Hz)，8.72(s，1H)，6.3(t，1H)5.40(m，4H)，5.21(d，1H)，4.45(q，1H)，4.29 ～ 4.17(m，2H)，2.82(t，2H)，2.35 ～ 2.42(q，2H)，2.15 ～ 2.05(m，4H)，1.65(m，2H)，1.38 ～ 1.27(m，14H)，0.91(t，3H)。

2.4 質譜分析

目標產物的MS分析見圖4。

亞油酸去氧氟尿苷酯的分子量是508.6，由圖4可知，質譜圖中出現的509.2峰為［M+H］質信號，由此可以斷定，TLC圖中出現的新物質為亞油酸去氧氟尿苷酯。

圖4 目標產物的質譜分析Fig.4 Mass spectrum of target product

2.5 催化劑的選擇

在酯化反應中，其核心是催化劑。傳統的濃硫酸催化往往有較多的副產物，分離困難，且會腐蝕設備并污染環境。因此，我們采用DCC/DMAP為催化劑，進行 Steglich酯化反應［11］，簡易、高效、無污染。該反應機理為:羧酸與 DCC反應，生成活性比羧酸更強的O-酰基異脲。

酰基異脲受醇進攻，產生DCU和相應的酯:

反應中的O-酰基異脲可發生1，3-重排生成N-酰基脲，從而不能與醇再發生作用，成為反應的副產物。為此需要加入親核性的 DMAP，作為酰基轉移試劑，以減少副反應的發生。

3 結論

采用DCC/DMAP催化亞油酸和去氧氟尿苷在無水體系中酯化，合成了亞油酸去氧氟尿苷酯。其反應條件為:底物摩爾比 n(LA)∶n(FU)=1∶1.2，室溫反應18 h。通過核磁共振及質譜表征了目標產物的組成與結構。

［1］王鳳翼.嬰兒配方乳粉中亞油酸與維生素E的添加量［J］.中國乳品工業，1987，12(6):258-267.

［2］秦歷杰，劉占舉.轉鐵蛋白阿霉素脂質體的制備及其對肝癌細胞系的殺傷活性［J］.華人消化雜志，2007，15(12):1441-1445.

［3］趙海濤，李寧，桑新亭，等.肝癌靶向治療的研究進展［J］.癌癥進展雜志，2008，6(3):293-298.

［4］趙子明.亞油酸和聚蘋果酸雙接枝殼聚糖新型納米載體材料及共增強抗腫瘤藥物功效研究［D］.上海:復旦大學，2009.

［5］王惠.抗惡性腫瘤新藥——去氧氟尿苷［J］.中國臨床藥學雜志，1996，5(3):126-127.

［6］王衛東.5-氟尿嘧啶類抗癌藥物的分子修飾研究進展［J］.藥學進展，2008，32(12):536-542.

［7］Grem J L.5-Fluorouracil:Forty-plus and still ticking.A review of its preclinical and clinical development［J］.Invest New Drugs，2000，18:299-313.

［8］Nishizawa Y，Casida J E.3’，5’-Diesters of 5-fluoro-2’-deoxyuridine:Synthesis and biological activity［J］.Biochem Pharmacol，1965，14:1605-1609.

［9］Kawaguchi T，Saito M，Suzuki Y，et al.Specificity of esterases and structure of prodrug esters.II.Hydrolytic regeneration behavior of 5-fluoro-2’deoxyuridine(FUdR)from 3’，5’-diesters of FUdR with rat tissue homogenates and plasma in relation to their antitumor activity［J］.Chem Pharm Bull(Tokyo)，1985，33:1652-1659.

［10］Yasuhiro Tsume，John M Hilfinger，Gordon L Amidon.Enhanced cancer cell growth inhibition by dipeptide prodrugs of floxuridine:Increased transporter affinity and metabolic stability［J］.Mol Pharmaceutics，2008，5(5):717-727.

［11］Neises B，Steglich W.Simple method for the esterification of carboxylic acids［J］.Angew Chem Int Ed，1978，17:522-524.