母乳和嬰兒配方奶粉中唾液酸體外模擬消化研究

孫晨 劉麗波 李春* 劉寧 2*

1.東北農業大學 食品學院 乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030；2.黑龍江省乳品工業技術開發中心(國家乳業工程技術研究中心)，哈爾濱150028

母乳是嬰兒最理想的天然食物。它含有嬰幼兒生長發育所必需的各種營養成分，對嬰幼兒存活、生長和發育都極為重要，且其具有最高的生物利用率[1]。母乳中含有豐富的功能性低聚糖，比如唾液酸，它是一類酸性九碳單糖，一種神經氨酸衍生物，可以促進嬰兒大腦的發育并且提高學習能力[2]。唾液酸的主要來源是母乳，尤其是初乳中的含量最高，以寡聚糖、糖蛋白和糖脂形式存在[3-4]。人乳中唾液酸的含量在250-1500mg/L，而目前市售嬰兒配方奶粉中唾液酸含量不及200mg/L[5]。目前，美國嬰兒配方奶粉通過添加酪蛋白糖巨肽來增加唾液酸的含量，使其接近人乳中總含量[6]。雖然在總含量上接近人乳，但蛋白質結合唾液酸約占70 %，游離、低聚糖結合約占30 %，這與人乳中唾液酸存在模式(蛋白質結合唾液酸約占24 %，游離、低聚糖結合唾液酸占76 %）相差很大，可能會使嬰兒配方奶粉中的唾液酸在胃腸內不能充分吸收和利用，對嬰兒大腦神經系統發育產生不利影響[7-8]。實驗室參照人乳中唾液酸含量和國外嬰兒配方奶粉中唾液酸添加標準，研制干法添加游離唾液酸嬰兒配方奶粉。通過添加游離唾液酸來降低嬰兒配方奶粉中蛋白質結合唾液酸所占的比例，使其與人乳唾液酸存在模式更加接近，進而在消化吸收方面與母乳相似。通過測定，當添加量為0.14-0.28kg/t時，嬰兒奶粉中唾液酸的含量可達到生產要求。雖然添加量達到生產要求，但嬰兒配方奶粉中唾液酸在體內消化情況我們還不了解。因此本文采用胃蛋白酶和胰蛋白酶模擬嬰兒體內消化環境，研究嬰兒配方奶粉中唾液酸的消化性，并與母乳進行對比，優化嬰兒配方奶粉中唾液酸的添加量，為進一步研究和開發添加唾液酸的嬰兒配方奶粉提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4,5-亞甲二氧基-1,2-鄰苯二胺鹽酸鹽(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediaminedi hydrochloride，DMB)、Neu5Ac標準品、胃蛋白酶1∶10000、胰蛋白酶1∶250 美國Sigma公司；甲醇與乙腈(均為色譜純) 天津市科密歐化學試劑有限公司；硫酸、三氟乙酸、三氯乙酸、冰醋酸、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、β-巰基乙醇(均為分析純)天津市光復化學精密研究所；半成品嬰兒配方奶粉 內蒙古伊利乳業有限公司；唾液酸(Neu5Ac)乳品科學教育部重點實驗室自制。Waters 2695高效液相色譜系統，配有可變紫外檢測器和Empower色譜工作站 美國Waters公司(帶熒光檢測器)；依利特RP-18柱(250mm×4mm，5μm)大連依利特分析儀器有限公司；0.22μm微孔濾膜 北京優晟聯合科技有限公司；K-100型超聲儀 上海研永超聲儀器有限公司；DKS-12型電熱恒溫水浴鍋 上海百典儀器設備有限公司；超速離心機 上海安亭科學儀器廠；HK5干粉混合機 萊州市科達化工機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 添加唾液酸嬰兒配方奶粉的制備 根據嬰兒配方奶粉的干法[9]生產流程（如圖1），將唾液酸與半成品嬰兒配方奶粉進行干混，營養成分和感官指標均符合國家要求。配方1：唾液酸添加量為1.4kg/t；配方2：唾液酸添加量為2.1kg/t；配方3：唾液酸添加量為2.8kg/t.

圖1 唾液酸干法添加工藝流程圖Fig. 1 Flow chart of adding sialic acid by dry production

1.2.2 母乳樣品的采集 對中國東北地區不同泌乳階段的健康產婦隨機采集三組樣本，采用自動采乳機采集人乳20mL左右，將獲得的人乳直接放入無菌塑料容器中，蓋上乳樣瓶蓋，搖勻。把乳樣分裝到2個10毫升的離心管中，按不同階段分成三組（每組三個樣品），粘貼上統一的標簽，放到離心管架上，置于-20℃冰箱中，待檢。

1.2.3 體外模擬消化 體外胃的消化：配制100mL（2g）奶樣，于37℃水浴鍋中預熱10min。加入濃度為1mol/L的HCl調pH至3，加入1 g胃蛋白酶，并不斷的攪拌。水解1h，用濃度為1 mol/L的NaOH調pH至7[10]。

體外腸的消化：稱取1 g胰蛋白酶，加入到上述水解液中，不斷攪拌2h。到時間后沸水浴5 min滅活。冷卻后放置室溫，待測[10]。

1.2.4 唾液酸含量的測定 利用高效液相色譜法[11-12]測定唾液酸的組分及含量。色譜條件：色譜柱：依利特 RP-18柱；流動相：甲醇：乙腈：水＝7∶8∶85( 體積比)；熒光檢測波長：373nm；柱溫：30℃；流速：0.9 mL/min；進樣量：10μL.

檢測結果分為兩部分：游離和低聚糖結合唾液酸含量的測定；蛋白質結合含量的測定。雖然唾液酸也有少部分以糖脂(神經節苷脂)的形式存在，但是其在嬰兒配方乳粉中占總唾液酸含量的比例卻很低(＜0.5%)，所以本研究未單獨檢測(包含于游離和與低聚糖結合唾液酸中)。嬰兒配方乳粉中總唾液酸含量即為游離唾液酸、低聚糖結合唾液酸和蛋白結合唾液酸含量之和。

1.3 統計分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS軟件進行統計分析，數據處理。除非特別說明，所有數據都是三次測試的平均值。

2 結果與分析

2.1 母乳和嬰兒配方奶粉中唾液酸的濃度測定結果

根據不同階段采集母乳樣分為三組，每個樣品組三個樣品，母乳樣組中唾液酸的含量為三個樣品的平均值。

從表一中可以看出，母乳中游離、低聚糖結合唾液酸約占總唾液酸含量的 70%，蛋白質結合唾液酸約占 30%。雖然嬰兒配方奶粉中唾液酸的含量接近母乳，但是唾液酸不同結合形式的比例與母乳有差別。這與這幾年來的研究結果相一致[13]，即母乳中唾液酸約 70%與低聚糖結合，嬰兒配方奶粉中唾液酸約 70%與蛋白質結合。干法生產添加唾液酸嬰兒奶粉時，隨著游離唾液酸添加量的增大，游離、低聚糖結合唾液酸在總唾液酸含量中的比例增大，蛋白結合唾液酸含量比例減小。嬰兒配方奶粉3在含量和結合模式中比較接近母乳。

2.2 唾液酸在人工模擬胃腸液中的消化率

2.2.1 唾液酸在人工模擬胃液、腸液中的消化率 唾液酸在人工模擬胃液和人工模擬腸液中的消化率結果如圖1、圖2所示。

圖2 不同樣品中唾液酸的體外胃消化率Fig.2 The vitro gastric digestibility of sialic acid in different samples

圖3 不同樣品中唾液酸的體外腸消化率Fig.3 The vitro intestinal digestibility of sialic acid in different samples

由圖2、圖3可知，嬰兒配方奶粉的唾液酸消化率與母乳有一定的差別。在人工模擬胃液、腸液的環境中，嬰兒配方奶粉中唾液酸的消化率均高于母乳的消化率，主要表現在嬰兒配方奶粉中蛋白質結合唾液酸的消化率，而游離、低聚糖結合唾液酸的消化率在母乳與嬰兒配方奶粉的對比中差異不明顯。這是由于嬰兒配方奶粉中蛋白質結合唾液酸比例比較大，經過胃蛋白酶、胰蛋白酶的分解，蛋白質結合唾液酸消化率變化明顯。

另外，從各組樣品中唾液酸的體外胃、腸消化效果方面看，占總消化率的50%以上的唾液酸是在腸內進行消化分解的。因為嬰兒在攝入食物1h之內，胃內pH急劇上升，最高可達6左右，遠高于胃蛋白酶的最適pH，同時母乳或配方乳液在嬰兒胃內一般只停留1～1.5h，便轉入小腸進行進一步的消化吸收。另一方面嬰兒腸道中分泌的胰蛋白酶活性高，數量也較多，嬰兒攝入的蛋白只有少部分在胃中得以消化分解，大部分蛋白是小腸中得以消化吸收。因此，蛋白質結合的唾液酸在腸液中消化比胃液中消化率大。本研究中樣品體外消化體系pH和消化時間均充分模擬嬰兒腸胃的真實環境，所以在一定程度上模擬了唾液酸在嬰兒體內的消化情況。

2.2.2 唾液酸在人工模擬胃腸環境的總消化率

圖4 不同樣品中唾液酸的體外總消化率Fig.4 The vitro total digestibility of sialic acid in different

從實驗結果可知，3組母乳樣品雖然是不同泌乳階段，唾液酸含量不同，但總消化率差異不明顯（p＞0.05）。嬰兒配方奶粉1，嬰兒配方奶粉2唾液酸含量達到母乳的水平，但由于蛋白質結合唾液酸比例大，總消化率遠遠高于母乳（p＜0.05）。嬰兒配方奶粉3的總消化率雖然高于母乳的消化率，但差異并不明顯（p＞0.05），表明嬰兒配方奶粉3的唾液酸消化過程與母乳接近。干法生產添加唾液酸嬰兒配方奶粉時，隨著游離唾液酸添加量的增大，嬰兒配方奶粉3在唾液酸的含量和結合模式上都與母乳接近，因此，消化情況也更接近母乳。即說明干法生產添加唾液酸的嬰兒配方奶粉，添加量2.8 kg/t為最優添加量。

2.3 唾液酸在人工模擬胃腸環境中不同時點的消化率變化研究

在體外模擬胃腸反應實驗中，分別在人工模擬胃液反應的10、20、30、40、50、60min取樣，在人工模擬腸液的反應的10、20、30、60、90、120min取樣測定其消化率,結果如圖5、圖6所示。

圖5 唾液酸在人工模擬胃液中不同時點的消化率Fig.5 The vitro gastric digestibility of sialic acid in different time

圖6 唾液酸在人工模擬腸液中不同時點的消化率Fig.6 The vitro intestinal digestibility of sialic acid in different time

由圖5、圖6可知，唾液酸的變化率隨時間升高呈現先升后降的趨勢，人工模擬胃液中在30min時達到峰值，人工模擬腸液中在60min內達到峰值。隨著時間的延長，唾液酸在人工模擬胃液、腸液中的消化率均有所下降。雖然唾液酸在母乳和嬰兒配方奶粉中含量有所不同，但消化率整體趨勢相同。從圖中還可看到，嬰兒配方奶粉3的消化率變化最接近母乳。

3 結論

目前，市售嬰兒配方奶粉中唾液酸的含量遠遠低于母乳中唾液酸含量。添加唾液酸到嬰兒配方奶粉中，對于混合喂養和人工喂養的嬰兒神經系統生長發育來說，是至關重要的。由于唾液酸添加量的不同，使唾液酸在嬰兒配方奶粉中的結合模式與母乳存在差異。因此，通過模擬嬰兒體內消化環境，對母乳和嬰兒配方奶粉中唾液酸的胃腸道消化率進行對比分析，選擇最優的添加量。最終得出：在母乳和嬰兒配方奶粉中，唾液酸在腸內的消化率高于胃中的消化率，并且唾液酸在人工模擬胃液環境反應30min，其消化率變化最大；在人工模擬腸液環境反應 60min時，其消化率變化最大。嬰兒配方奶粉中唾液酸的消化率高于母乳中唾液酸的消化率，主要表現在蛋白質結合唾液酸。當干法生產添加量為2.8 kg/t時，嬰兒配方奶粉中唾液酸的消化率接近母乳。由此說明此添加量既滿足生產的要求并且在消化吸收方面與母乳相似，因此為最優添加量。

[1]王光慈.食品營養學[M].北京: 中國農業出版社,2001,107.

[2]Varki A. Sialic acids in human health and disease [J]. Cell, 2008, 14(8): 351-360.

[3]Mart?nSosa S, Mar?a JM, Garc?aPardo LA, et al. Distribution of Sialic Acids in the Milk of Spanish Mothers of Full Term Infants During Lactation [J]. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 2004, 39: 499-503.

[4]Lacomba R, Salcedo J, Alegrí a A, et al. Sialic acid (N-acetyl and N-glycolylneuraminic acid)and ganglioside in whey protein concentrates and infant formulae[J]. International Dairy Journal, 2011, 21: 887-895.

[5]Vé ronique S, Michaud J, Austin S, et al. Determination of sialic acids in milks and milk-based products [J].Analytical Biochemistry, 2010, 405: 28-40.

[6]MCmahon. Compositions and methods of formulation for enteral formulas containing sialic acid: United States,US 2005/0096295 A1. May 5, 2005.

[7]Schauer R. Sialic acids: fascinating sugars in higher animals and man [J]. Zoology, 2004, 107: 49-64.

[8]Huan Nie, Yu Li, Xue-LongSun, et al. Recent advances in sialic acid-focused glycomics [J].Journal of Proteomics, 2012, 75: 3098 - 3112.

[9]陳輝，霍貴成. 干法生產嬰兒配方乳粉[J]. 中國乳品工業，2002，30(5)：103-105.

[10]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國藥典.第二部[M].北京：化學工業出版社，2000.

[11]陳海嬌，王萍，陳越，等.高效液相色譜法測定母乳中唾液酸含量[J]. 食品科學，2011，32(16)：308-311.

[12]Salcedo J, Ramó n L, Alegrí a A, et al. Comparison of spectrophotometric and HPLC methods for determining sialic acid in infant formulas [J]. Food Chemistry, 2011, 127: 1905-1910.

[13]Wang B , Janette B, Patricia M, et al. Concentration and distribution of sialic acid in human milk and infant formulas [J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 2001, 74: 510-515.