黑魚酶解產物肽的制備工藝研究

李艷平

（吉林農業工程職業技術學院,吉林四平 136000）

我國是世界上水產品產量最大的國家之一，淡水魚資源豐富，黑魚作為淡水魚，具有營養豐富，蛋白質含量高等特點。但黑魚肉較粗，不是太好吃，將黑魚蛋白水解是解決黑魚肉粗，口感差的一種新的途徑。將黑魚蛋白酶解制備黑魚多肽，既提高營養價值，也有一定的功能特性。生物活性肽已被證實具有降膽固醇[1]、降血壓[2]、抑菌[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、免疫調節[6]、促進有益微量元素及營養素吸收[7]等功效。本試驗以黑魚肉蛋白為原料，進行黑魚肉酶解工藝參數的最佳條件研究，一般認為影響酶解效果的因素有7個：底物濃度、pH、溫度、時間、酶用量、抑制劑、激活劑。抑制劑、激活劑既影響酶解速度又會引入不確定的因素，出于成本及食品安全性的考慮，不對這兩個影響因素進行討論。目前利用淡水魚酶解制備多肽研究的不少，但利用淡水魚中的黑魚為原料進行酶解制備功能性食品的研究基本沒有，因此最佳的酶解工藝能促進黑魚深加工的發展，提高經濟效益。本課題主要研究黑魚蛋白酶解最佳工藝參數，為黑魚蛋白肽抗氧化特性驗證提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑魚 四平地直市場鮮活黑魚；硫酸鋰、鎢酸鈉、鉬酸鈉、三氯乙酸 分析純；酪氨酸、酪蛋白 生化試劑；硫酸鋰AR、鎢酸鈉AR、鉬酸鈉AR、酪蛋白、酪氨酸、三氯乙酸AR、中性蛋白酶(ASI.398)、復合蛋白酶(Protamex)諾維信天津公司；木瓜蛋白酶(Papain)、堿性蛋白酶(Alcalase)北京奧博星生物技術有限責任公司；各酶水解參數見表1。

電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；722型可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；PHS-3C型數字酸度pH計 上海楚定分析儀器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器 武漢萊莫檢測設備有限公司；溫度計 天津市天馬儀器廠；恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠；TDL一80一ZB型離心機 上海安亭科學儀器廠。

表1 各酶水解參數Table1 The hydrolysis parameter of several protease

1.2 試驗方法

1.2.1 黑魚前處理

將新鮮的黑魚洗凈，去頭、尾、內臟后，分別取皮、背部、腹部、兩側紅肉和白肉，用搗碎機將其搗碎成均勻的糜狀，然后分別用保鮮袋包裝，放到冰箱冰凍備用[8]。

1.2.2 黑魚蛋白酶解工藝

參照Quaglia,G.B.等人[4]對沙丁魚的酶解方法并做部分修改。具體酶解過程如下：取冷凍的黑魚精肉切塊前解凍，然后破碎進行脫脂處理，將魚肉與異丙醇1：1（V：V）在46℃循環浸提 1h，浸提后將樣品置于通風處除去并揮發剩余的異丙醇，加水勻漿形成魚糜液，再按[E]/[S]=1%魚糜液的用量加入蛋白酶,蛋白酶在pH8，溫度50℃下攪拌水解至一定時間，將酶解液放到沸水浴中加熱使酶失去活性，冷卻，然后以4000r/min的轉速離心10min。上清液即為黑魚酶解液。

1.2.3 酸溶性多肽含量的測定

采用TCA-SN 指數法，其定義為：在特定條件下三氯乙酸(TCA)水溶液中可溶性氮的物質的量的分數；常采用的是10%的三氯乙酸。TCA-SN指數反映了水解產物的溶解性能；同時，也表明了水解產物物質的量的分布；在一定程度上是蛋白質水解程度的一種表征。

式中，C：上清液中蛋白質的濃度，mg/mL；

V：10%TCA的總體積，mL；

W：蛋白質樣品的質量，g。

1.2.4 由酸溶性多肽含量確定最佳用酶和最適酶解時間

不同蛋白酶有不同特異酶切位點，因而蛋白酶選擇是制備生物活性肽過程中一個重要環節。本試驗研究的目的是黑魚蛋白通過限制性酶解后，盡可能獲得肽類產物，而不是氨基酸，因此，肽提取率的高低成了評定水解效果的最主要標準。在以酸溶性多肽確定所選最佳酶試驗中，所選用各種蛋白酶，都在各酶的理論的最適條件下反應，酶解的溫度為各種酶的最適溫度，酶解的pH值為最適pH值，為保證各種酶對黑魚蛋白水解能力的可比性，加酶量均為[E]/[S]=1%，酶解時間5h，主要研究黑魚蛋白水解過程中，不同的蛋白酶水解液的肽提取率隨著水解時間延長的變化趨勢。

1.2.5 堿性蛋白酶最佳作用條件研究方法

1.2.5.1 單因素對黑魚蛋白水解的影響

不同pH值對水解效果的影響：取黑魚魚糜3份，每份重40克，加水調料液使底物濃度[S]為1%(w/v)，調pH值為8、9、10時，按照[E]/[S]為1%的加酶量分別加堿性蛋白酶，混勻，在其最適溫度下水解4h，沸水浴滅酶活。測多肽含量。

反應溫度對水解效果的影響：取黑魚魚糜3份，每份重40克，加水調料液使底物濃度[S]為1%(w/v)，pH自然，按照[E]/[S]為1%的加酶量分別加堿性蛋白酶，混勻，在溫度分別為45、50、55℃下水解4h，沸水浴滅酶活。測多肽含量。

加酶量對水解效果的影響：取黑魚魚糜3份，每份重40克，加水調料液使底物濃度[S]為1%(w/v)，調pH9。分別加入1.5%、1.0%、2.0%的蛋白酶，最適溫度下水解4h后，測多肽含量。

底物濃度對堿性蛋白酶酶解的影響：取黑魚魚糜3份，每份重40克，加水調料液使底物濃度[S]分別為1.0%、1.5%、2.0%，調pH9。按照[E]/[S]為1%的加酶量分別加堿性蛋白酶，混勻，其最適溫度下水解4h。測多肽含量。

1.2.5.2 采用正交試驗研究了水解溫度、加酶量、料液比、起始pH對多肽含量的影響

根據以上試驗結果，最適水解時間為4h，以反應溫度、加酶量、底物濃度與起始pH為試驗因子，以多肽含量指標，進行了L9( 34)正交試驗，因素水平如表2。

表2 正交試驗方案設計表Table 2 L9 ( 34 )Factor and Level

2 結果與討論

2.1 由酸溶性多肽含量確定的最佳用酶和最適水解時間

在各酶的最適宜條件下測得的多肽含量如圖1所示.

圖1 不同蛋白酶水解黑魚的多肽含量曲線Fig.1 Curve of TCA-SN in process of different proteinase hydrolysis Snakehead Protein

由圖1可知，堿性蛋白酶酶解的多肽含量最高，5h時的含量為28.56%；中性酶酶解多肽含量最低，從圖中可看出，前4h的多肽含量增幅較快，4h后變化緩慢。為了節約時間，所以水解最佳酶解時間確定為 4h。多肽含量除了與蛋白酶種類不同外，它也受酶解的溫度和底物濃度等的影響。

2.2 單因素試驗對堿性蛋白酶酶解影響

2.2.1 不同pH對堿性蛋白酶酶解反應的影響

堿性蛋白酶有其最適的pH，pH過大或過小，底物和酶分子的帶電狀態就會改變，就會導致酶的活力降低[9]，不同pH在水解4h后對多肽含量的影響如圖2所示。

圖2 不同pH對酶解產物多肽含量的影響Fig. 2 Effect of different pH on DH in process of alkaline protease hydrolysis

由圖2可知，隨著起始pH的增加，多肽含量呈現由最初的增幅快到慢的趨勢。由于酶分子是一種特殊的蛋白質分子，活性部位較多，酶的活性部位由結合點和催化位點組成，結合部位和催化部位對反應體系的pH值變化敏感，解離狀態也隨pH值變化而變化，pH過高過低對酶解都有不利的影響。因此確定pH9時多肽含量最高為堿性蛋白酶最適pH。

2.2.2 不同溫度對酶解產物多肽含量的影響

每種蛋白酶有其各自的水解的最適水解溫度，但最適溫度也是隨著水解蛋白底物的性質的改變而變化，并不是對于所有的蛋白底物其最適水解溫度都一樣。不同溫度對酶解產物多肽含量的影響如圖3所示。

圖3 不同溫度對多肽含量的影響Fig.3 Effect of different temperature on DH in process of alkaline protease hydrolysis

從圖3可看出，用堿性蛋白酶酶解黑魚時，酶解產物多肽含量開始也是隨著溫度的升高而增大，當水解時間為4h時，水解溫度為50℃時的多肽含量最高，而水解溫度為55℃時，2h后多肽含量增大緩慢，溫度過高，酶解位點被隱藏，也影響酶的作用效果，溫度過高還會使底物蛋白發生變性。確定堿性蛋白酶水解的最適溫度為50℃。

2.2.3 不同加酶量對酶解產物多肽含量的影響

堿性蛋白酶在使用過程中依據應用說明書有一個基本推薦用量，但是各種蛋白酶的合適量跟最適水解溫度一樣，也是隨著水解蛋白底物的性質的改變而變化，一般情況下酶用量增加會提高酶解效率，而且酶用量稍微大些對于水解反應本身是沒有不良效果，但是酶用量一旦大于最適濃度，效果不會太明顯，可能還會引起酶自溶增強[10]，酶用得多使用成本就高，因此應當根據底物的情況來確定其合適的用量，即酶用量也存在一個所謂的“經濟濃度”。因此，本試驗的目的是研究堿性蛋白酶以黑魚蛋白為作用底物時的合適用量。試驗結果如圖4所示。

圖4 不同加酶量對多肽含量的影響Fig.4 Effect of different enzyme loading on the TCA-SN

由圖4可看出，多肽含量是隨著酶添加量的增加而增大，但當酶添加量超過1.5%時，多肽含量上升緩慢，酶添加量為1.5%的多肽含量與酶添加量2%的多肽含量相差不多，由于酶價格高，因此從經濟成本出發，選酶用量為1.5%的最合適。

2.2.4 不同底物濃度對酶解多肽含量的影響

不同蛋白酶其活性也受底物濃度的影響，堿性蛋白酶酶解體系也有其最合適的底物黑魚蛋白初始濃度，本試驗就是測定在取得最高多肽利率的情況下，底物濃度的最適值。試驗結果如圖5。

圖5 不同底物濃度對多肽含量的影響Fig. 5 Different effects of substrate on the impact of TCA-SN

由圖5可知，底物濃度為1.5%的多肽含量隨水解時間延長增加速度快，底物濃度高于1.5%的當達到一個最大值后增長緩慢，原因是酶催化能力達到極限，魚溶液中不存在有活性游離的酶，所有活性酶都與底物結合，過高的底物濃度抑制水解反應的順利進行，也會導致后續的處理過程中將浪費更多的資源。濃度太低導致蛋白酶和作用底物兩者的碰撞機率太少，因此依據圖5，選擇底物濃度1.5%最為合適。

2.3 正交試驗結果

由于本試驗的主要考核指標是多肽含量，所以以多肽含量為指標做正交試驗。表3以多肽含量TCA-SN(%)為指標的正交試驗結果。

表3 最佳水解條件的正交試驗結果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表3可知，在水解時間為4h的前提下，以多肽含量為考核指標，影響試驗結果的主次因素為D→B→A→C，最優組合為A1B2C3D2。即水解溫度50℃，加酶量1.5%，底物濃度2%，起始pH9。在此條件下做驗證試驗，結果表明多肽含量為29.5%,高于正交試驗所列出的任何一組，所以選用這個組合條件為最佳條件。

3 結論

本文主要研究了黑魚肉酶解的單因素試驗，單因素試驗表明用堿性蛋白酶酶解黑魚，酶解的條件是水解溫度50℃，加酶量1.5%，底物濃度1.5%，起始pH9，以此為依據設計了正交試驗，對酶解工藝進行優化，正交試驗結果表明：堿性蛋白酶酶解黑魚最佳條件是底物濃度1.5%，起始pH9，溫度50℃，加酶量1.5%，在此條件下驗證試驗中用堿性蛋白酶酶解黑魚蛋白，酶解后的多肽含量為29.5%。

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