響應面法優化提取香椿葉總膳食纖維的工藝條件及其抗氧化活性研究

劉 靜，李湘利，張 艷，胡彥營，朱九濱

(濟寧學院生命科學與工程系，山東曲阜273155)

膳食纖維是一類不被人體消化的多糖類碳水化合物和木質素的總稱，能有效預防和減少結腸癌、糖尿病、冠心病、肥胖癥、心肌梗塞等疾病的發生，被譽為人體的“第七大類營養素”［1－2］。膳食纖維的生理功能多與其抗氧化活性有關，不同來源的膳食纖維，抗氧化活性差異較大［3］。

香椿(Toona Sinensis(A.Juss.)Roem)是我國的一種綠色保健菜［4］，具有清除體內自由基、抗氧化衰老、維持毛細血管脆性和調節人體微循環等功效［5］;它還有清熱解毒、健胃理氣、殺蟲和固精等作用［6］。現有研究表明，香椿葉提取物具有抗氧化活性［7－8］和抑菌作用［9］。目前，關于香椿葉的研究多集中于黃酮類［10］、多酚物質［11］等方面，而關于總膳食纖維(Total dietary fiber，TDF)提取及其抗氧化活性尚缺乏系統研究。本實驗通過單因素實驗和響應面分析方法，以香椿葉TDF得率為指標，優化了中性蛋白酶提取TDF的工藝參數，并對其抗氧化活性進行探討，旨在為開發天然抗氧化劑資源及香椿葉綜合利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香椿葉 2012年9月采自本校教工生活區;耐高溫α－淀粉酶 北京東華強盛生物科技有限公司，2000U/g;中性蛋白酶 南寧龐博生物工程公司，40萬U/g;纖維素酶 湖州米純生物科技有限公司，10萬U/g;無水乙醇、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH)等，分析純。

FCD2000鼓風干燥箱 上海瑯玕實驗設備有限公司;2H－25C多功能食品加工機 澳柯瑪小家電有限公司;pHS－3C酸度計 上海宇隆儀器有限公司;RE201B旋轉蒸發儀 南京金正教學儀器有限公司;HH－S24S數顯恒溫水浴鍋 上海躍進醫療器械廠;TD6低速離心機 長沙英泰儀器有限公司;723PC分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香椿葉TDF提取工藝 香椿葉→烘干→粉碎→過篩→香椿葉粉→脫脂→干燥→復合酶酶解→滅酶→冷卻→中性蛋白酶酶解→滅酶→冷卻→乙醇沉淀→離心→洗滌→沉淀→干燥→產品TDF

1.2.2 操作要點 將香椿葉于60℃烘干至恒重，粉碎，過40目篩，用石油醚脫除脂肪，蒸餾水洗凈;干燥后按料液比1∶20(g/mL)加入蒸餾水，調節pH6.0，添加0.2%復合酶(纖維素酶∶淀粉酶=1∶1)于60℃酶解2h［12］，煮沸滅酶;冷卻后加一定量的中性蛋白酶在一定的pH、溫度、時間下進行酶解，然后煮沸滅酶;冷卻后加4倍體積95%乙醇沉淀1h，4000r/min離心10min，沉淀分別用15mL的78%乙醇、95%乙醇和丙酮各沖洗2次，105℃烘干即得香椿葉TDF。

1.2.3 TDF提取條件的優化 在單因素實驗的基礎上，以酶解pH(X1)、酶解溫度(X2)、酶解時間(X3)、酶添加量(X4)為自變量，TDF得率(Y)為響應值，設計四因素三水平的二次回歸方程擬合自變量和TDF得率之間的函數關系，采用響應面分析法優化提取工藝條件，各實驗因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

TDF得率的計算公式為:

1.2.4 化學成分的測定 水分，直接干燥法(GB5009.3－2010);灰分，直接灰化法(GB5009.4－2010);蛋白質，考馬斯亮藍染色法［13］;淀粉，酸水解法(GB/T5009.9－2008);脂肪，索氏抽提法(GB/T5009.6－2003);產品膳食纖維，酶重量法(AOAC991.43)。

1.2.5 香椿葉TDF抗氧化能力實驗

1.2.5.1 對DPPH·的清除作用 采用比色法測定［14］。用無水乙醇將10mg/mL TDF溶液分別稀釋成質量濃度為 2、4、6、8、10mg/mL 的溶液。在試管中加入1.0mL TDF溶液，4.0mL 1.0×10－4mol/L DPPH溶液(95%乙醇配制)25℃水浴反應30min，測定517nm處吸光度(用蒸餾水作參比)。另用去離子水配制與TDF溶液等濃度的VC溶液，做陽性對照實驗，重復3次(下同)。

式中:Ax為4.0mL DPPH溶液+1.0mL樣品溶液;Ax0為4.0mL 95%乙醇+1.0mL樣品溶液;A0為4.0mL DPPH溶液+1.0mL蒸餾水。

1.2.5.2 對O－2·的清除作用 采用鄰苯三酚自氧化法測定［15］。在試管中加入 4.5mL 0.05mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH8.2)、1.0mL TDF溶液、0.4mL 45mmol/L的鄰苯三酚溶液(0.01mmol/L HCl配制)搖勻，25℃反應5min后加入0.1mL 8mmol/L HCl溶液終止反應，測定325nm處吸光度(用蒸餾水作參比)。

式中:Ax為4.5mL緩沖液+1.0mL樣品溶液+0.4mL鄰苯三酚溶液;Ax0為4.5mL緩沖液+1.0mL樣品溶液+0.4mL 0.01mol/L HCl溶液;A0為4.5mL緩沖液+1.0mL蒸餾水+0.4mL鄰苯三酚溶液。

1.2.5.3 對·OH的清除作用采用Fenton反應體系模型測定［12］。在試管中加入1.0mL 9mmol/L水楊酸－乙醇溶液、1.0mL TDF溶液、1.0mL 9mmol/L FeSO4溶液，最后加入1.0mL 8.8mmol/L H2O2溶液啟動反應，于37℃保溫30min后，測定510nm處吸光度(用蒸餾水作參比)。

式中:Ax為1.0mL水楊酸－乙醇溶液+1.0mL樣品溶液+1.0mL FeSO4溶液+1.0mL H2O2溶液;Ax0為1.0mL水楊酸－乙醇溶液+1.0mL樣品溶液+1.0mL FeSO4溶液+1.0mL蒸餾水;A0為1.0mL水楊酸－乙醇溶液+1.0mL蒸餾水+1.0mL FeSO4溶液+1.0mL H2O2溶液。

2 結果與分析

2.1 中性蛋白酶提取香椿葉TDF的單因素實驗結果

2.1.1 酶解pH對香椿葉TDF得率的影響 由圖1可知，脫脂干燥后的香椿葉粉添加0.2%的中性蛋白酶，在60℃下酶解60min，香椿葉TDF得率隨pH升高而增加，pH6.0時，TDF得率最高可達71.69%;pH高于6.0時，TDF得率下降。這是因為pH過高，酶活性中心的構象甚至整個酶分子結構發生改變，酶蛋白變性、失活，從而導致原料水解不完全［16］。故酶解pH為6.0較合適。

圖1 pH對香椿葉TDF得率的影響Fig.1 Effect of pH on the yield of TDF from Toona Sinensis leaves

2.1.2 酶解溫度對香椿葉TDF得率的影響 由圖2可知，脫脂干燥后的香椿葉粉添加0.2%的中性蛋白酶，在pH6.0酶解60min，香椿葉TDF得率隨酶解溫度升高，呈現先升高后下降的趨勢。尤以60℃時TDF得率最高，可達71.75%;70℃時，TDF得率降為60.59%。這主要是由于溫度過低不利于酶與底物接觸，溫度過高易引起酶失活所致。故酶解溫度以60℃為宜。

圖2 酶解溫度對香椿葉TDF得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on the yield of TDF from Toona Sinensis leaves

2.1.3 酶解時間對香椿葉TDF得率的影響 由圖3可知，脫脂干燥后的香椿葉粉添加0.2%的中性蛋白酶，在pH6.0、60℃下酶解，香椿葉TDF得率隨酶解時間的延長呈現鐘形變化曲線。以酶解60min時，TDF得率最高可達71.60%。由于隨酶解時間的增加，部分可溶性膳食纖維溶解損失，降低了 TDF得率［17］。故酶解60min為宜。

圖3 酶解時間對香椿葉TDF得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the yield of TDF from Toona Sinensis leaves

2.1.4 酶添加量對香椿葉TDF得率的影響 由圖4可知，脫脂干燥后的香椿葉粉添加中性蛋白酶在pH6.0、60℃下酶解60min，香椿葉TDF得率在酶添加量0.2%時，最高可達71.57%;隨加酶量的繼續增加，TDF得率反而下降。因為樣品中殘留的蛋白質隨著蛋白酶用量的增加而降解;也可能是膳食纖維中的碳氮鍵被過量的蛋白酶降解，加之部分水溶性膳食纖維流失，造成TDF得率降低［18］。故中性蛋白酶添加量宜選擇0.2%。

圖4 酶添加量對香椿葉TDF得率的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on the yield of TDF from Toona Sinensis leaves

2.2 香椿葉TDF提取工藝條件的優化

2.2.1 模型的建立 利用Design Expert8.0.7.1軟件的中心組合設計(Box－Behnken)選項，可獲得香椿葉TDF提取的四因素三水平實驗設計，實驗方案及結果見表2。

表2 響應面實驗設計方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface experiments

利用Design Expert軟件對表2的實驗結果進行分析，得到各因素與TDF得率之間的回歸方程:

對回歸模型進行方差分析的結果(表3)表明:回歸模型極顯著(p＜0.01)，而失擬項差異不顯著(p＞0.05)，說明回歸模型與實測值能較好地擬合;一次項(X1、X2、X3)與二次項(X12、X2

2、X32、X42)對TDF得率影響極顯著(p＜0.01)，交互項(X1X2)影響顯著(p＜0.05)，其他項影響不顯著(p＞0.05)。由F值的大小可以推斷，在所選實驗范圍內，各因素對香椿葉TDF得率的影響順次為:酶解pH＞酶解時間＞酶解溫度＞酶添加量。

表3 響應面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the built regression model

2.2.2 響應面分析 利用Design Expert軟件得到二次回歸方程的響應面，酶解pH和酶解溫度對TDF得率的影響見圖5。由圖5可知，酶解時間和酶添加量保持不變時，隨著酶解pH和酶解溫度的延長，TDF得率呈先增加后降低的趨勢;等高線呈橢圓形說明酶解pH與酶解溫度的交互作用顯著，這與方差分析結果一致。

圖5 酶解pH和酶解溫度對TDF得率影響的響應面圖Fig.5 Response surface of enzymolysis pH and temperature on the yield of TDF

2.2.3 最佳提取條件的確定與驗證 應用Design Expert軟件，得到香椿葉 TDF最佳提取工藝為pH5.82、酶解溫度60.72℃、酶解時間50.2min、酶量添加0.2%。結合實際可操作性，選取最優提取條件為pH5.8、酶解溫度61℃、酶解時間 50min、酶添加量0.2%，并在此條件下進行驗證，TDF得率為72.45%，這與模型預測值(72.47%)非常接近，這表明該模型可用于中性蛋白酶提取香椿葉TDF的得率預測。

2.3 組成成分分析

由表4可知，所得產品中TDF含量為72.69%，高于樣品中的含量;除灰分外，各種雜質成分含量較低，說明除雜效果較好。

表4 樣品及產品主要成分(%)Table 4 The main composition of sample and product(%)

2.4 香椿葉TDF對DPPH·的清除作用

由圖6可知，香椿葉TDF對DPPH·具有清除作用。TDF濃度在2～10mg/mL時，對DPPH·清除作用隨濃度增大而加強，且清除率與TDF濃度呈現一定的相關性。利用Microsoft Excel 2003的CORREL函數［19］，對TDF濃度與 DPPH·清除率進行相關性分析，得二者相關系數為0.9906;應用FORECAST函數［20］計算清除 50%DPPH·所需 TDF濃度 IC50=3.26mg/mL。以VC作標準抗氧化劑，在相同濃度下對DPPH·清除率均大于98%，這說明香椿葉TDF對DPPH·清除能力弱于VC。

2.5 香椿葉TDF對·的清除作用

圖6 香椿葉TDF對DPPH·的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of TDF from Toona Sinensis against DPPH·

圖7 香椿葉TDF對O2－·的清除能力Fig.7 Scavenging capacity of TDF from Toona Sinensis against O2－·

2.6 香椿葉TDF對·OH的清除作用

由圖8可知，香椿葉TDF對·OH具有清除作用。TDF濃度在2～6mg/mL時，對·OH的清除率隨濃度的增加而增強;TDF濃度高于6mg/mL時，對·OH清除率增加緩慢，10mg/mL時，清除率為27.38%。相同濃度下，VC對·OH清除率在95%～97%之間，這說明香椿葉TDF對·OH清除能力弱于VC。

圖8 香椿葉TDF對·OH的清除能力Fig.8 Scavenging capacity of TDF from Toona Sinensis against·OH

3 結論

在單因素實驗基礎上，采用Box－Behnken中心組合設計以中性蛋白酶酶解pH、酶解溫度、酶解時間、酶添加量為自變量，以香椿葉TDF得率為響應值，得到四元二次數學回歸模型。應用Design expert軟件對所得模型進行分析，得到中性蛋白酶提取TDF的最佳工藝條件為酶解pH5.8、酶解溫度61℃、酶解時間50min、酶添加量0.2%，香椿葉TDF得率可達72.45%。

香椿葉TDF具有一定的抗氧化活性。香椿葉TDF濃度在2～10mg/mL時，對DPPH·具有較強的清除能力，IC50為3.26mg/mL;對·、·OH 最高清除率分別為35.13%和27.38%，但其清除三種自由基的能力均弱于VC。

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