特異性擬桿菌引物在珠江三角洲的適應性研究

王海鷹,賈樂華,吳仁人,王菊芳,寧正祥

(1.華南理工大學生物科學與工程學院,廣東 廣州510006；2.環境保護部華南環境科學研究所,廣東 廣州510640；3.廣東省水與大氣污染防治重點實驗室,廣東 廣州510640；4.華南理工大學輕工與食品學院,廣東 廣州510006)

特異性擬桿菌引物在珠江三角洲的適應性研究

王海鷹1,賈樂華1,吳仁人2,3*,王菊芳1,寧正祥4

(1.華南理工大學生物科學與工程學院,廣東 廣州510006；2.環境保護部華南環境科學研究所,廣東 廣州510640；3.廣東省水與大氣污染防治重點實驗室,廣東 廣州510640；4.華南理工大學輕工與食品學院,廣東 廣州510006)

在珠江三角洲地區采集人、豬、牛、狗以及家禽等33個糞便樣品,高效提取基因組DNA,選取14種特異性擬桿菌引物進行檢驗分析,并進一步采用已知污染源類型的水樣對其進行驗證.結果表明:采用糞便樣品DNA專屬提取試劑盒和水體樣品DNA專屬提取試劑盒提取的基因組模版純度和提取率均符合后續實驗要求.擬桿菌通用引物2#(Bac32F/Bac708R)檢出率為85%(28/33),特別是對哺乳類動物和雞的糞便具有更高的檢出率.人的擬桿菌特異性引物3#(HF134F/ Bac708R)和4#(HF183F/Bac708R)、反芻動物的擬桿菌特異性引物8#(CF128F/Bac708R)以及豬的擬桿菌特異性引物10#(PF163F/Bac708R)在珠江三角洲地區同時具有較高的靈敏度和較強的特異性.水體樣品驗證實驗與實際污染類型相符,說明擬桿菌通用引物2#、人的特異性引物3#和4#以及豬的特異性引物10#在珠江三角洲地區具有很好的適用性.

擬桿菌；特異性引物；靈敏度；特異性；珠江三角洲地區

隨著我國畜禽養殖的發展及規模的擴大,糞便產生量的不斷增加,畜禽養殖業帶來的生態環境問題也變得日益突出[1].未經處理(或未完全處理)的糞便隨徑流進入地表水,造成環境水體中微生物污染較為普遍[2].由于缺乏糞便污染來源的準確信息使得目前治理仍停留在見污治污階段,極大增加了污染治理的難度與成本.近年來,歐美等發達國家紛紛開展了以宿主特異性生物標記為基礎的水體微生物污染源解析的研究工作,并已開發出了豬[3]、牛[4-5]、人[6-8]、雞[9]、野禽[10-11]等動物的多種特異性引物.

然而,宿主消化道內各種腸道菌群之間的相互作用極為復雜,并且外界環境的差異性易導致消化道內菌群的基因發生變化,造成不同地區特異性基因表達差異的現象較為普遍,如Okabe等[12]針對豬體設計的引物Bac41F/PS183R 在日本的札幌和江別市進行檢測時具有很好的特異性,而 Mieszkin等[13]在法國驗證的結果表明該引物雖然在豬的糞便樣品中可完全得到擴增,但在其他某些動物的糞便樣品中也有陽性結果產生.

目前,部分已開發出的宿主特異性引物在當地已有很好的驗證,但其特異性在我國尚不明確,因此應積極開展地域適應性的生物標記研究.本研究提取珠江三角洲地區人和多種動物糞便樣品的 DNA,選取不同的特異性引物對宿主 DNA進行驗證,并進一步采用已知污染來源的水樣驗證,以探尋其地域適應性,為珠江三角洲地區水域糞便污染來源分析提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器:PCR 儀(ALD1234, ALS1296, Bio-Rad公司),冷凍離心機(5804R,Thermo公司),凝膠成像儀(212PRO,GelLogic公司)

主要試劑:糞便基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司),omega Water DNA Kit (OMEGA Bio-Tek D5525-01),PCR kit(2× Reaction Mix,Taq DNA聚合酶,廣州東盛生物科技有限公司),蛋白酶 K(天根生化科技有限公司),DNA marker(Takara),瓊脂糖(Biowest,電泳級).

1.2 樣本采集

1.2.1 糞便樣品 2013年4～5月在廣東境內東江和北江流域的多個畜禽養殖場采集家禽、家畜、狗等生物糞便樣品,在醫院的配合下采集廣州地區人的糞便樣品.糞便樣品數共計33份,其中:廣州市蘿崗區13份、廣州市白云區9份、廣州市越秀區5份、廣東省清遠市1份、廣東省惠州市5份;雞9份、豬8份、牛6份、人5份、鴨2份、狗1份、鵝1份、鴿1份.所有樣品編號,保存于冰盒中,在6h內運抵實驗室進行后續實驗.

1.2.2 水體樣品 對已知造成糞便污染的水體進行樣品采集.其中廣州市污水處理廠A和B進水口水樣各1份、以及惠州某生豬養殖場旁水塘水樣1份.樣品編號,保存于冰盒中,在6h內運抵實驗室進行后續實驗.

1.3 DNA提取

糞便樣本基因組 DNA提取:采用糞便基因組DNA提取試劑盒通過懸浮、破碎、吸附柱純化等步驟從糞便樣品中提取基因組DNA,具體步驟按照說明書進行.

水體樣本基因組DNA提取:用0.22μm微孔濾膜過濾水樣,將濾膜剪碎置于50mL離心管中,按照omega Water DNA Kit的說明,提取水體中的DNA.DNA 樣品于-20℃保存備用.

1.4 PCR擴增

擬桿菌通用引物及人和不同動物擬桿菌引物見表1. PCR反應體系20μL:2×Reaction Mix10μL,Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)0.4μL,10μmol/L上下游引物各0.8μL,DNA模板(5ng/μL)0.4μL,滅菌超純水7.6μL; PCR擴增條件:94℃預變性3min,94℃變性30s,53～62℃退火30s(不同引物退火溫度具體見表1),72℃延伸90s,重復30個循環,72℃延伸10min; PCR結果檢測:以2000bp DNA marker為標準,PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳.

1.5 數據分析

靈敏度(r)和特異性(s)分析采用以下公式計算:r＝[TP/(TP＋FN)] ,s＝[TN/(TN＋FP)][14].其中:TP表示PCR引物對自己種屬的樣品進行擴增時的陽性樣本數(真陽性),FN表示PCR引物對自己種屬的樣本進行擴增時的陰性樣本數(假陰性);TN表示PCR引物對其他種屬的樣品進行擴增時的陰性樣本數(真陰性),FP表示PCR引物對其他種屬的樣品進行擴增時的陽性樣本數(假陽性).

表1 不同宿主的擬桿菌特異性生物標記引物Table1 Host-specific primers of Bacteroidales from selected species

2 結果與討論

2.1 基因組DNA提取

采用試劑盒抽提的糞便基因組DNA和水樣基因組DNA的濃度、提取率以及A260/A280的比值如表2所示.在電泳圖中這些條帶明亮且單一,可以用于后續PCR實驗.本研究使用的專屬糞便基因組DNA和水樣基因組DNA提取試劑盒中的離心吸附柱能高效、專一吸附DNA,最大限度地去除雜質蛋白及其他有機化合物.將 CTAB法以及試劑盒提取方法得到的基因組DNA進行了對比,發現采用試劑盒抽提方法得到的基因組純度和提取率均符合后續實驗的要求,并且在對大量樣本進行抽提時具有效率高,穩定性好等優點.

2.2 糞便樣品對特異性生物標記引物的驗證

以得到的糞便樣品基因組 DNA為模板,選取已有擬桿菌通用引物,人的擬桿菌引物,反芻動物擬桿菌引物以及豬的擬桿菌引物,分別進行PCR擴增,每一對引物擴增得到的陽性樣本數統計結果以及靈敏度和特異性分析分別見表3和表4.

采用擬桿菌通用引物(1#、2#)對33個糞便樣品(人、豬、牛以及家禽等)和1個作為陰性對照的大腸桿菌樣品分別進行PCR擴增,陽性樣本分別為15和28個.如表3中統計所示,鴨、鵝、鴿樣品在用擬桿菌通用引物、人的擬桿菌引物、豬的擬桿菌引物、反芻動物擬桿菌引物進行 PCR擴增時,均為陰性.這與之前的文獻中指出禽類和鳥類與人、豬、牛、羊等哺乳動物糞便中的優勢菌群存在差異的報道一致.總體而言,擬桿菌為人、豬、牛、羊等哺乳動物糞便中的優勢菌群[21],而禽類和鳥類與之有較大差異.如Lu等[9]在雞的糞便中提取了471個基因序列,多樣性結果顯示微生物分屬19個不同的菌屬,主要有梭狀芽孢桿菌(20.9%)、芽孢桿菌(17.3%)和擬桿菌(15.0%),在野鵝糞便中芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌為優勢菌屬[10].對比可知,2#引物在以擬桿菌為優勢菌群的哺乳類動物糞便中具有更高的檢出率,對雞糞便中擬桿菌也有很好的識別.

表2 糞便樣品和水體樣品基因組DNA濃度,A260/A280值以及提取率Table2 Absorbance ratio of260/280nm, concentration and extraction rate of genome DNA of fecal and water samples

為了考察各類已開發的特異性引物的地區適應性,采集生物糞便樣品分別進行驗證.采用人的特異性引物(3#～7#)分別對所采集的樣品進行PCR擴增,除3#外其它引物對人類糞便均有100%靈敏度.但5#和6#引物除了對人類糞便外,對豬、牛、雞等動物糞便也具有假陽性響應,而4#和7#引物的特異性較好(分別為96%和93%).當采用反芻動物特異性引物對牛糞便樣本進行PCR檢測時,8#引物的靈敏度和特異性均為100%.而9#引物分別為67%和41%,不適合于目標研究區域使用.豬的特異性引物(10#～14#)靈敏度都比較高,只有11#引物在所檢測的6個樣本中陽性結果為83%,其他引物均能全部擴增得到目標產物.在靈敏度相對較高的4對引物中,10#和14#引物的特異性最好,分別為92%和95%,但引物14在進行PCR擴增時得到的目標條帶較引物10弱.綜合以上結果可知,擬桿菌通用引物2#(Bac32F/ Bac708R)、人的特異性引物3#(HF134F/ Bac708R)和引物4#(HF183F/Bac708R)、反芻動物特異性引物8#(CF128F/Bac708R)以及豬的特異性引物10#(PF163F/Bac708R)同時具有較高的靈敏度和較強的特異性,在目標研究區域具有很好的適應性.同時,由于鵝、鴿、狗等動物不是珠江三角洲地區常見養殖品種,以致只采集到有限數量的樣本,本研究所采用的生物標記引物對其特異性有待進一步加強驗證.

擬桿菌近年來被廣泛應用在水體微生物源解析領域.與大腸桿菌相比,擬桿菌在哺乳動物糞便的數量遠遠大于大腸桿菌,在水體中有較長的存在時間,同時擬桿菌中的一些特異性的分子標記比大腸桿菌的檢測更為靈敏,具有更好的宿主特異性.但由于宿主消化道內各種腸道菌群之間的相互作用極為復雜,并且外界環境的差異性易導致消化道內菌群的基因發生變化,因此特異性引物存在較明顯的地區差異性.如對加拿大安大略省和美國俄亥俄州野鵝糞便的生物多樣性比對發現,前者芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌兩種優勢菌分別占46.3%和38.4%,而后者則分別為30.2%和28.9%[10].在特異性基因表達方面,因地區差異造成特異性基因表達不同的現象更為普遍.如 Okabe 等[12]針對豬體設計的引物Bac41F/ PS183R(12#)在日本的札幌和江別市進行檢測時具有很好的特異性,而Mieszkin 等[13]在法國布列塔尼地區驗證的結果表明該引物雖然在豬的糞便樣品中可完全得到擴增,但是在其他物種的一些樣品中也有陽性結果產生.本研究中,該引物在部分人類、牛和雞的糞便中可被擴增,也證明其地域差異性,不適合在珠江三角洲地區使用.此外,Bernhard等[17]設計了人的2種特異性引物 HF134F/ Bac708R(3#)和HF183F /Bac708R(4#),驗證發現3#引物與其他的動物之間沒有發現交叉反應,且在人的糞便樣品中普遍存在,同時具有較好的敏感性和特異性,4#引物只在不到一半的人糞便樣品中有特異性擴增.而在珠江三角洲地區的驗證發現,3#引物雖然有很好的特異性,但靈敏度僅為80%.但4#引物在目標研究區域中對所檢測的5個人糞便樣品有全部陽性響應,其它30個非人糞便樣品中,僅有一個假陽性響應.可見4#引物適合在珠江三角洲地區推廣使用.

2.3 已知污染源水樣對特異性生物標記引物的驗證

表3 擬桿菌引物PCR陽性結果Table3 Positive results obtained with Bacteroidales biomarkers

表4 擬桿菌引物靈敏度與特異性分析Table4 Sensitivity and specificity of the Bacteroidales biomarkers analyzed

擬桿菌是常寄居哺乳動物體內的一類革蘭氏陰性、無芽孢、專性厭氧的細菌[22],其在有氧條件下存活的狀態不盡相同,大部分擬桿菌在有氧環境中只能存活幾個小時.但仍有擬桿菌的DNA 在水體中存在數天乃至數周仍然可以被檢測到,為其在微生物溯源中的應用提供了可能[23].而目前不同擬桿菌生物標記進入環境中的存在時間和遷移轉化規律尚不明確.因此,采用上述實驗中靈敏度和特異性均較好的引物(擬桿菌通用引物2#、人特異性引物3#和引物4#、反芻動物特異性引物8#、豬特異性引物10#)分別對廣州市污水處理廠A和B(生活污水)進水口、以及惠州某生豬養殖場旁水塘等已知污染源類型的水樣進行分析檢驗,結果如圖1～圖3所示.

圖1 A水處理廠進水口水樣PCR擴增結果Fig.1 Water genome DNA from water treatment company A amplified with host-specific different Bacteroidales primers

圖2 B污水處理廠進水口水樣PCR擴增結果Fig.2 Water genome DNA from water treatment company B amplified with host-specific different Bacteroidales primers

圖3 惠州農村豬舍旁水塘水樣PCR擴增結果Fig.3 Water genome DNA from the pool next to the hoggery of Huizhou amplified with host-specific different Bacteroidales primers

當采用擬桿菌通用引物2#(Bac32F/Bac708R)對上述水樣進行PCR擴增時,所有樣品均有目標條帶的擴增(條帶2),推測水樣受到糞便污染.采用人的特異性引物3#(HF134F/Bac708R)和4#(HF183F/Bac708R)對水樣進行擴增時,兩個生活污水處理廠進水口的水樣均得到了目標條帶(條帶3和4),豬舍旁水塘的水樣未有目標條帶,表明市政污水中有人類糞便的排放,但豬舍旁水塘未受受到人類糞便污染.當上述水樣都采用反芻動物特異性引物8#(CF128F/Bac708R)進行PCR擴增時,均未得到目標條帶,說明市政污水和豬舍旁水塘的水體并沒有受到牛、羊等反芻動物糞便的污染.以上說明實驗結果與事情情況完全相符.采用豬的特異性引物10#(PF163F/Bac708R)對水樣進行 PCR擴增時,豬舍旁水塘的水 PCR結果為陽性,而生活污水處理廠進水口的水PCR結果也為陽性,只在采用相同的模板量進行擴增時,生活污水處理廠進水口的水擴增條帶稍微弱一些,但是因為沒有采用定量PCR,所以不能嚴格區分這兩者的差別.實驗室自來水采用上述5對引物進行PCR擴增時,結果都為陰性(圖4).

目前,擬桿菌常作為特異性生物標記用來檢測水體中糞便污染來源.本實驗根據已有的擬桿菌通用引物、人、反芻動物以及豬的擬桿菌引物,對珠江三角洲地區采集的糞便樣品進行驗證,得到多個適合目標研究區域且靈敏度較高和特異性較好的引物,并初步在已知污染來源的水樣中得到驗證.在本實驗中,由于客觀條件的限制,分析的糞便樣本以及已知污染來源的水樣樣本數相對較少,需要進一步進行大量樣本的驗證,為珠江三角洲地區水體環境提供可靠的糞便污染來源分析.此外,由于自然環境和社會發展水平等因素的差異,歐美與我國在微生物源解析研究的關注點上有較大不同.比如美國農場牛的存欄數為8930萬頭(截至2013年1月1日),每年牛糞產生量約10億t[24],為畜禽廢棄物的最大來源.愛爾蘭每年畜禽養糞便產生量約為1億t,其中牛和羊的產生量占總量的96%[25].而我國畜禽養殖主要以豬和禽類為主,以廣東為例,豬和雞糞便的年產生量約占總量的63%,牛糞只占約17%,與歐美的社會情況相比有著非常明顯的差異.歐美等國在對反芻動物和的微生物多樣性[26]、源解析[27]和病源微生物[28]等方面有較多研究,但對豬和家禽類的關注相對較少.因此,需針對我國特色加強種類單一、地區適應性不好的特異性引物設計和開發工作.

圖4 實驗室自來水水樣PCR擴增結果Fig.4 Tap water genome DNA of the lab amplified with host-specific different Bacteroidales primers.

3 結論

3.1 擬桿菌為哺乳類動物糞便的優勢菌群,因此具有更高的檢出率.

3.2 識別出人的特異性引物 4#(HF183F/ Bac708R)、反芻動物特異性引物8#(CF128F/ Bac708R)以及豬的特異性引物10#(PF163F/ Bac708R)在珠江三角洲地區同時具有較高的靈敏度和較強的特異性.

3.3 水體樣品驗證實驗與實際污染類型相符,說明擬桿菌通用引物2#(Bac32F/Bac708R)、人的特 異 性 引 物 3#(HF134F/ Bac708R)、4#(HF183F/Bac708R)和 豬 的 特 異 性 引 物10#(PF163F/Bac708R)在珠江三角洲地區具有很好的適用性.

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Study on sensitivity and specificity of the Bacteroidales biomarkers for microbial source tracking in the Pearl River Delta region.

WANG Hai-ying1, JIA Le-hua1, WU Ren-ren2,3*, WANG Ju-fang1, NING Zheng-xiang4
(1.School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou510006, China；2.South China Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Guangzhou510655, China；3.The key Laboratory of Water and Air Pollution Control of Guangdong Province, Guangzhou510655, China；4.School of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou510006, China). China Environmental Science,2014,34(8)：2118～2125

A total of33 fecal samples of human and different animal species were collected in the Pearl River Delta region. Genomic DNA were then efficiently extracted and amplified by using14 specific Bacteroidales primers that have been reported as tracking markers of different sources. Primers with high specificity and sensitivity were then selected and used for polluted water samples analysis. The results show that the purity and extract efficiency of the genome DNA meet the requirement of the following experiments.85% of the33 fecal samples analyzed were positive when using Bacteroidales universal primer2#(Bac32F/Bac708R), and most of the mammalian animals and chicken fecal samples were detected as positive samples when use this primer. Human-specific marker3#(HF134F/Bac708R) and4#(HF183F/Bac708R), ruminant-specific marker8#(CF128F /Bac708R)and porcine-specific marker10#(PF163F/Bac708R)showed high sensitivity and specificity in the Pearl River Delta region. Polluted water samples analysis results were the same as the actual type of pollution, implying Bacteroidales universal primer2#, human-specific primer3#and4#and porcine-specific primer10#could be used as pollution tracking markers in the Pearl River Delta region.

t：Bacteroidales；specific markers；sensitivity；specificity；Pearl River Delta region

X172

：A

：1000-6923(2014)08-2118-08

王海鷹(1983-),女,湖南沅江人,博士,主要從事微生物檢測方面研究.

2013-12-02

國家自然科學基金項目(41303054);廣東省自然科學基金項目(S2012040007463);中國博士后科學基金面上資助項目(2012M521593);中國博士后科學基金特別資助項目(2013T60796)

* 責任作者, 工程師, wurenren@scies.org