李氏膈食散體外抗腫瘤實驗研究

夏方博+李徐+劉亞旻+郭智+沈勝楠+潘瑞樂

[摘要] 目的 研究李氏膈食散 體外抗腫瘤作用。 方法 采用水提和醇提的方法提取李氏膈食散的復方中的水溶和醇溶性成分。MTT 法測定水提物和醇提物對肝癌細胞（HpeG-2）、胃癌細胞（MKN-45）、食道癌細胞（EC-109）的抑制作用。 結果 兩種提取物對三種腫瘤細胞株均有體外抗腫瘤作用，且以乙醇提取物效果更好。乙醇提取物對HpeG-2、MKN-45、EC-109三種腫瘤細胞株的半數抑制濃度分別為：622.89、173.41和210.17 μg/mL，最大抑制率在90%左右。 結論 李氏膈食散提取物在體外具有抑制HpeG-2、MKN-45、EC-109生長的作用。

[關鍵詞] 李氏膈食散；消化系統；體外；抗腫瘤

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）02（b）-0021-04

Studying on the antitumor effect of Chinese herbal prescription of "Li Shi Ge Shi San" in vitro

XIA Fangbo1 LI Xu2 LIU Yamin1 GUO Zhi1 SHEN Shengnan1 PAN Ruile1▲

1.Institute of Medicinal Plant Development， Peking Union Medical College， Chinese Academy of Medical Science， Beijing 100193， China； 2.Lixuqin Physicians of Clinic Office of Bao′an District in Shenzhen City， Guangdong Province， Shenzhen 518101， China

[Abstract] Objective To study the antitumor effect of Chinese herbal prescription of Li Shi Ge Shi San in vitro. Methods The water soluble and alcohol soluble ingredients in this prescription were extracted by using the water and alcohol. MTT colorimetric method was used to investigate the inhibitory effects of water extract and ethanol extracts from Li Shi Ge Shi San on hepatoma carcinoma cell （HpeG-2）， gastric carcinoma cell （MKN-45） and ephageal cancer cells （EC-109）. Results Two extracts of prescription significantly inhibited the cell survival rate of three cancer cells， and the ethanol extract had better effects than the water extract on anticarcinogenic action. The half inhibitory concentrations of ethanol extract on HpeG-2， MKN-45 and EC-109 were 622.89， 173.41 and 210.17 μg/mL respectively. The maximal inhibition rate of ethanol extracts reached about 90%. Conclusion The extract of Li Shi Ge Shi San can inhibit the growth of HpeG-2， MKN-45 and EC-109 in vitro.

[Key words] Li Shi Ge Shi San； Digestive system； In vitro； Antitumor

癌癥是嚴重威脅人類健康和社會發展的重大疾病之一，也是目前威脅我國居民健康的重大疾病。最近統計數據顯示，我國癌癥發病率呈逐年上升趨勢，其中消化系統癌癥如胃癌、結腸癌等癌癥占全部癌癥構成的10%以上，均為危害較大的常見腫瘤[1]。目前臨床上常用的放化療方法治療腫瘤，在殺傷腫瘤細胞的同時，也造成機體骨髓抑制和免疫功能低下，毒副作用大。因此從天然的動物、植物及礦物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物或活性成分是近年來國內外學者研究的熱點。中醫藥是我國特有的傳統醫藥寶庫，在我國用于防病治病已有2000多年的歷史，為抗癌藥物的研發提供了十分豐富的資源。

李氏膈食散是根據祖輩行醫經驗并吸取歷代各家治療食管癌的理論精髓，形成的具有獨特療效的經驗方。李氏膈食散由阿魏、蟾蜍、馬寶、白花蛇舌草等中藥根據中醫理論配伍而成，臨床應用已數十年，經觀察對食道癌、胃癌等消化道癌癥有顯著療效，能有效消除癌癥腫塊、減輕患者痛苦，并能促進食欲，延長癌癥患者壽命。本研究從體外證明李氏膈食散水提取物和醇提取物對消化道腫瘤細胞如人肝癌細胞（HepG-2）、人胃癌細胞（MKN-45）以及人食道癌細胞（EC-109）的抑制作用，為李氏膈食散臨床治療消化道腫瘤提供現代研究證據。

1 儀器與試藥

1.1 藥物

李氏膈食散由廣東省深圳市寶安區李徐欽西醫內科診所提供。

1.2 細胞系

人肝癌細胞（HepG-2）、人胃癌細胞（MKN-45）、人食道癌細胞（EC-109），均購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。

1.3 試劑儀器

95%乙醇（分析純，北京化工廠），DMSO（分析純，北京化工廠），RPMI 1640培養基（Solarbio公司，中國），胰蛋白酶（Solarbio公司，中國），胎牛血清（Gibco公司，美國），磷酸鹽緩沖液（Thermo公司，德國），噻唑藍（MTT）試劑（Gibco公司，美國）。純水儀（Millipore公司，美國），96孔細胞培養板（Thermo公司，德國），倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本），二氧化碳培養箱（Thermo公司，德國），連續波長酶標儀（BIO-TEK，美國）。

2 方法與結果

2.1 李氏膈食散水提取物的制備

稱取李氏膈食散生藥粉末10 g，加10倍量水回流提取3次，每次30 min，過濾，濾液合并，真空干燥，得到李氏膈食散水提物，得率為16.8%。

2.2 李氏膈食散乙醇提取物的制備

稱取李氏膈食散生藥粉末10 g，加10倍量95%乙醇溶液回流提取3次，每次30 min，過濾，濾液合并，真空干燥，得到李氏膈食散乙醇提取物，得率為10.5%。

2.3 李氏膈食散水提物或醇提物抑制腫瘤細胞生長的測定

取對數生長期的肝癌細胞株（HepG-2）、胃癌細胞株（MKN-45）以及食道癌細胞株（EC-109）消化計數后接種于96孔培養板中，每孔8000～10 000個細胞，培養12 h，棄去培養液，加入不同濃度的含藥培養基100 μL繼續培養24 h，吸出培養液，每孔加入150 μL磷酸鹽緩沖溶液加入100 μL 0.5 g/L的MTT溶液，繼續培養4 h候棄去MTT溶液，每孔加入150 μL DMSO溶解，平板震蕩儀震蕩15 min，在酶標儀上用波長570 nm，參比波長為450 nm的條件測定各孔吸光度值（OD），計算抑制率：[抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%]，并求出各濃度半數抑制濃度（IC50）。

2.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析及t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2.5 結果

2.5.1 李氏膈食散水提物對三種腫瘤細胞的抑制作用 李氏隔食散水提取物在濃度為15.62～1000.00 μg/mL范圍內對HepG-2、MKN-45以及EC-109均有一定的抑制作用，相對而言，對HepG-2的抑制作用稍強，其IC50為143.59 μg/mL。而對胃癌細胞株（MKN-45）以及食道癌細胞株（EC-109）在此濃度范圍內抑制率不超過50%。組間比較，各類腫瘤細胞株抑制率差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見表1～3。

表1 李氏膈食散水提物對肝癌細胞HepG-2的抑制作用（x±s，n = 8）

注：“-”表示無數據；IC50：半數抑制濃度

表2 李氏膈食散水提物對胃癌細胞MKN-45的抑制作用（x±s，n = 4）

注：“-”表示無數據，由于最大抑制率未達到50%，IC50無法計算；IC50：半數抑制濃度

表3 李氏膈食散水提物對食道癌細胞EC-109的抑制作用（x±s，n = 8）

注：“-”表示無數據；IC50：半數抑制濃度

2.5.2 李氏膈食散醇提物對三種腫瘤細胞的抑制作用 李氏膈食散醇提取物在濃度為23.44～1500 μg/mL范圍內對HepG-2、MKN-45以及EC-109均有較好的的抑制作用，最高抑制率在90%左右，對HepG-2、MKN-45及EC-109三種細胞株的；IC50分別為：622.89、173.41和210.17 μg/mL。組間比較，各類腫瘤細胞株抑制率差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見表4～6。

表4 李氏膈食散乙醇提取物對肝癌細胞HepG-2的抑制作用

（x±s，n = 8）

注：“-”表示無數據；IC50：半數抑制濃度

表5 李氏膈食散乙醇提取物對胃癌細胞MKN-45的抑制作用

（x±s，n = 8）

注：“-”表示無數據；IC50：半數抑制濃度

表6 李氏膈食散乙醇提取物對食道癌細胞EC-109的抑制作用

（x±s，n = 4）

注：“-”表示無數據；IC50：半數抑制濃度

3 討論

李氏膈食散臨床使用的是散劑，即將藥材粉碎，過篩，混勻，即用于胃癌、食道癌等消化道腫瘤患者的治療，患者服用方法通常采用黃酒送服。由于體外細胞實驗時藥材粉末是不能進入細胞的，必須對藥材進行提取。本文對李氏膈食散進行水提取和醇提取兩種方法，并對兩種提取物均進行了體外抗腫瘤活性研究。實驗結果表明兩種提取物對HpeG-2、MKN-45、EC-109三種消化系統腫瘤細胞株均有體外抗腫瘤效果，以乙醇提取物效果更好。乙醇提取物對3種腫瘤細胞株最大抑制率在90%左右。本文的研究結果初步表明李氏膈食散脂溶性成分可能具有更好的抗腫瘤活性，也間接證明臨床采用黃酒服用是有一定的科學依據。

李氏膈食散復方主要由阿魏、蟾蜍、白花蛇舌草等傳統中藥配伍而成。阿魏是一味常用中藥，早在《新修本草》中就有記載[2]。阿魏有特殊的臭氣，味苦而辛，有理氣消腫、活血消疲、祛痰和興奮神經的功效[3-4]。趙貝等[5]通過整體、細胞、分子三個水平初步證明阿魏藥酒有一定的抗腫瘤作用，主要是通過阻止腫瘤的浸潤和轉移，提高機體免疫能力。蟾蜍首載于《名醫別錄》，早在《神農本草經》就載有“蝦蟆”的性味與主治。古今驗方廣泛應用蟾蜍、蟾酥拔毒消腫、定痛殺蟲、強心利尿。現已有蟾酥鎮痛膏、蟾酥注射液、華蟾素注射注和復方蟾皮膠囊等制劑應用于臨床抗腫瘤、鎮痛、利水消腫等[6]。現代研究表明蟾蜍膏對肺癌、肝癌、胃癌等多種癌痛緩解總有效率為92.65%[7]；蟾酥注射液對食道癌、賁門癌手術切除后治療1～2年生存率均高于單純手術組[8]；華蟾素治療原發性肝癌總有效率為52.1%～56%，采用自身對照方法評價有效率為45%[9]。白花蛇舌草味甘、淡、性涼，歸胃、大腸、小腸經，具清熱解毒、消腫鎮痛的功效，主治闌尾炎、氣管炎、尿道感染、毒蛇咬傷、腫瘤、腸風下血等[10]。體外實驗證明白花蛇舌草乙醇提取物對人低分化胃腺癌細胞（BGC）、人類口腔表皮樣癌細胞（KB）、人肝癌細胞（SMMC）、人宮頸癌細胞（HELA）、人肺癌細胞（A549）有一定的抑制作用[11-12]。體內證明白花蛇舌草乙醇提取物對小鼠移植性S180實體瘤有一定抑制作用[13]。以白花蛇舌草為君藥的醫院制劑中肝合劑，在治療中晚期原發性肝癌的臨床療效顯示能顯著提高Ⅲ期原發性肝癌患者的生活質量，延長生存時間[14]。李氏膈食散的主要藥味無論臨床還是實驗研究均具有良好的抗腫瘤效果，表明李氏膈食散復方配伍具有理論和和實踐應用的基礎。

李氏膈食散復方既有動物藥又有植物藥，各味藥的主要活性成分各不相同，蟾蜍抗腫瘤主要活性成分為蟾毒內酯類成分，屬強心苷類物質，包括蟾毒靈（bufalin）、脂蟾蜍配基（resibufogenin）、華蟾酥毒基（cinobufagin，又稱華蟾毒精）等[15]；阿魏主要活性成分為揮發油、香豆素和苯丙素等[3]，白花蛇舌草的主要活性成分有黃酮、三萜、有機酸及多糖等多種成分[16-17]，這些不同活性成分從腫瘤不同靶點發揮作用，充分體現中藥的多成分、多靶點作用特點，從整體調節機體功能達到去除疾病的目的。

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（收稿日期：2013-10-28 本文編輯：衛 軻）

李氏膈食散復方既有動物藥又有植物藥，各味藥的主要活性成分各不相同，蟾蜍抗腫瘤主要活性成分為蟾毒內酯類成分，屬強心苷類物質，包括蟾毒靈（bufalin）、脂蟾蜍配基（resibufogenin）、華蟾酥毒基（cinobufagin，又稱華蟾毒精）等[15]；阿魏主要活性成分為揮發油、香豆素和苯丙素等[3]，白花蛇舌草的主要活性成分有黃酮、三萜、有機酸及多糖等多種成分[16-17]，這些不同活性成分從腫瘤不同靶點發揮作用，充分體現中藥的多成分、多靶點作用特點，從整體調節機體功能達到去除疾病的目的。

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（收稿日期：2013-10-28 本文編輯：衛 軻）

李氏膈食散復方既有動物藥又有植物藥，各味藥的主要活性成分各不相同，蟾蜍抗腫瘤主要活性成分為蟾毒內酯類成分，屬強心苷類物質，包括蟾毒靈（bufalin）、脂蟾蜍配基（resibufogenin）、華蟾酥毒基（cinobufagin，又稱華蟾毒精）等[15]；阿魏主要活性成分為揮發油、香豆素和苯丙素等[3]，白花蛇舌草的主要活性成分有黃酮、三萜、有機酸及多糖等多種成分[16-17]，這些不同活性成分從腫瘤不同靶點發揮作用，充分體現中藥的多成分、多靶點作用特點，從整體調節機體功能達到去除疾病的目的。

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[14] 姜初明，龔黎燕.中肝合劑治療中晚期原發性肝癌58例[J].中國中西醫結合雜志，2005，29（9）：848.

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[17] 李濤，楊立，王志平，等.建立小鼠膀胱腫瘤原位模型的優化方法[J].中國實驗動物學報，2013，21（4）：30-34.

（收稿日期：2013-10-28 本文編輯：衛 軻）