不同前處理方法對保健食品中總皂苷含量測定的影響

彭維，李雙祁，歐愛芬

（1.廣州醫科大學，廣東廣州510182；2.廣州綠萃生物科技有限公司，廣東廣州510530；3.廣州市藥品檢驗所，廣東廣州510160）

皂甙（saponins），是廣泛存在于植物界的一類特殊的甙類，在植物界分布很廣，許多中藥例如人參、三七、知母、遠志、甘草、桔梗、柴胡等都含有皂苷。皂苷由皂苷元和糖、糖醛酸或其他有機酸組成[1]。有許多含皂苷類成分的中藥如遠志、桔梗等有祛痰止咳的功效[2]；有些皂苷還具有抗菌的活性或解熱[3]、鎮靜[4]、抗癌等有價值的生物活性[5-6]。在皂苷類成分的提取物中，往往伴隨著諸如糖類、鞣質等親水性較強的成分，給皂苷類成分的分離純化增加了難度[7]。因皂苷的苷元部分多為疏水性，能被非極性樹脂所吸附，同時由于皂苷分子較大，故孔徑較大的D-101型大孔吸附樹脂為理想的選擇[8]。吸附后，很容易用水將糖類等親水性成分洗脫下來。再用適宜濃度的乙醇溶液將吸附在樹脂上的皂苷類成分洗脫，達到分離純化的目的[9]。目前，大孔吸附樹脂法提取分離皂苷已被廣泛應用，如人參總皂苷[10]、三七總皂苷[11]、絞股藍總皂苷、毛冬青總皂苷等的提取分離。

傳統的比色法測定總皂苷含量時，一般只用大孔吸附樹脂對樣品進行純化、富集處理，很少對其進行脫色，而大孔吸附樹脂法只能去除提取液中的糖類、鞣質和淀粉等雜質，對色素的去除不理想，造成結果存在一定誤差。為了使實驗結果更接近于真實值，總皂苷的脫色純化處理成為重要一步。

1 試劑與儀器

1.1 材料

御和坊海狗丸（批號：20120101）；人參皂苷Re對照品，由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 儀器與試劑

U-3010 紫外可見分光光度計（HIACHI，Japan）、KUDOS超聲清洗器：上海科導超聲儀器有限公司；SG-4050型系列數顯恒溫水浴鍋：上海碩光電子科技有限公司。

D-101大孔吸附樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂：山東魯抗醫藥有限公司；層析用中性氧化鋁：上海納輝干燥試劑廠，AR；95%乙醇（AR）、無水乙醇（AR）、甲醇（AR）、高氯酸（AR）、冰醋酸（AR）、香草醛（AR）：廣州化學試劑廠。

2 方法

2.1 純化方法的比較

取海狗丸適量粉碎，精密稱取0.5 g試樣，置于50 mL容量瓶中，加適量蒸餾水，超聲提取30 min，再用蒸餾水定容至50 mL，搖勻，放置。

2.1.2 純化

分別精確吸取1.0 mL已處理好的試樣溶液（2.1.1），分別過D-101大孔吸附樹脂柱、D-101大孔吸附樹脂和氧化鋁柱、D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱，先用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，然后用25 mL 70%乙醇洗脫人參皂苷，收集洗脫液于蒸發皿中。

2.1.3 對照溶液的制備

精密稱取一定量的人參皂苷Re，用甲醇定容，配制成1 mL含0.2 mg的溶液，分別吸取人參皂苷Re對照品溶液（0.2mg/mL）0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 放蒸發皿上，按2.1.4置于60℃水浴揮干，進行測定，繪制標準曲線。線性關系為y=0.0016x+0.0719，R2=0.9986。

2.1.4 測定

將2.1.2的純化洗脫液置于60℃水浴揮干，在已揮干的蒸發皿中準確加入0.2 mL 5%的香草醛冰乙酸溶液，轉動蒸發皿，使殘渣都溶解，再加0.8 mL高氯酸，混勻后移入10mL帶塞刻度離心管中，60℃水浴上加熱10min，取出，冰浴冷卻后，準確加入冰乙酸5.0mL，搖勻后，以1 cm比色池于560 nm波長處測定其吸光度。根據標準曲線計算總皂苷的含量。

2.1.5 回收的制定

很多教師在課堂練習中沒有將新課程標準的相關理念與實際教學相結合，只注重書面練習，其他形式相對缺乏，如社會實踐題、口頭練習和動手練習等；在課堂練習中單純注重基礎知識和基本技能的訓練，缺少思維訓練，未能認識到學生個人思維的重要性。

精確吸取1.0 mL已處理好的試樣溶液，另加對照品溶液（0.2mg/mL）1.0 mL與試樣一起純化測定。

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性關系考察

精密稱取一定量的人參皂苷Re，用甲醇定容，配制成1 mL含0.2 mg的溶液，分別吸取人參皂苷Re對照品溶液（0.2mg/mL）0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，過 D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱，先用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，然后用25 mL 70%乙醇洗脫人參皂苷，收集洗脫液于蒸發皿中。按2.1.4置于60℃水浴揮干，進行測定，繪制標準曲線。

2.2.2 精密度考察

精密吸取人參皂苷Re標準液（0.2 mg/mL）1.0 mL放蒸發皿上，水浴揮干（低于60℃），或熱風吹干（勿使過熱），加適量蒸餾水溶解，過D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱，收集洗脫液于蒸發皿中，按2.1.4測定，測定6次，計算其RSD%值。

2.2.3 重復性考察

取試樣0.5 g，按“2.1.1預處理”后，精確吸取1.0 mL已處理好的試樣溶液，過D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱，收集洗脫液于蒸發皿中，按2.1.4測定。分別進行6次平行試驗。

2.2.4 加樣回收試驗

精密吸取重復性考察時預處理好的試樣1.0 mL，共取 9 份，分別精密加入標準液（0.2 mg/mL）0.5、1.0、1.5 mL（60℃以下揮干），配成高、中、低濃度試液各三份。過D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱，收集洗脫液于蒸發皿中，按2.1.4測定。

2.2.5 穩定性考察

取重復性考察處理好的供試品液于0、2.5 h與5 h分別測定其吸光度值。

3 結果與討論

3.1 純化方法比較

表1 3種純化方法測定總皂苷含量及其回收率Table 1 The content of total saponins and its recovery of the three purification method

由于保健食品所含成分較為復雜，測定其中的總皂苷含量易受糖分、鞣質、色素等成分的干擾。由表1看出，只經D-101吸附樹脂純化的試樣，所測得樣品總皂苷含量最大，經D-101吸附樹脂和氧化鋁純化的次之，經D-101吸附樹脂與D-941離子交換樹脂純化的最小，而經D-101與D-941樹脂的回收率最好，平均回收率達97.02%，其他兩種純化工藝的回收都欠佳。表明D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂除去保健食品中色素等其他雜質效果良好，而且不影響總皂苷含量，適用于保健食品中總皂苷含量測定的除雜與純化。

3.2 方法學可行性分析

3.2.1 線性關系考察

試驗結果圖1表明，人生皂苷Re檢測質量在0.02 mg～0.4 mg范圍內與吸光度呈良好的線性關系，回歸方程為：y=0.001 6x+0.071 9，R2=0.998 6。

圖1 標準曲線Fig.1 The standard curve

3.2.2 精密度考察

表2 精密度試驗結果（n=6）Table 2 Precision of test results

由表2試驗結果可見，6次測定結果的RSD值為0.27%，用D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱聯用純化樣品的測定方法精密度較好。

3.2.3 重復性考察

表3 重復性數據Table 3 Repeatability data

由表3試驗結果可見，6次測定結果的RSD值為0.79%，用D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱聯用純化樣品的測定方法重復性較好。

3.2.4 加樣回收試驗

表4 加樣回收數據Table 4 Recovery test data

由表4的試驗結果可見，用D-101大孔吸附樹脂柱和D-941大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱聯用純化樣品的平均回收率為98.62%，RSD值為1.66%（n=9），證實了該方法能有效地用于保健品中總皂苷的含量測定。

3.2.5 穩定性考察

結果表明，其吸光度在5h內人生皂苷Re及樣品溶液的吸光度變化很小，穩定性好，平均RSD為1.21%。

表5 穩定性數據Table 5 Stability data

4 結論與討論

保健食品中所含成分復雜，易對測定結果產生干擾。本實驗所用海狗丸主要原料為海狗精粉、人參、淮山藥、茯苓、熟地、淫羊藿、肉桂、淀粉硬脂酸鎂等，除皂苷外還含有大量的色素等其他雜質。本實驗過程中，試液過D-101大孔吸附樹脂后的洗脫液呈黃色，吸光度值最大，而過加氧化鋁的D-101吸附樹脂的洗脫液顏色相對較淡，吸光度次之，表明氧化鋁有一定的脫色作用，但脫色不完全；過D-101吸附樹脂后的洗脫液再過D-941離子交換樹脂，洗脫液呈現無色透明，其吸光度值最小，表明D-941離子交換樹脂的脫色效果明顯。而且從這3種純化方法的加樣回收來看，前兩種的回收率分別為94.86%和92.34%，回收率較低，而過D-941離子交換樹脂的試樣回收率達97.02%，遠高于前兩種。表明D-941離子交換樹脂脫色能力強，且不會吸附總皂苷，適用于保健食品中總皂苷的脫色純化處理。

本實驗用D-101大孔吸附樹脂與D-941離子交換樹脂柱聯用對保健食品中的總皂苷進行脫色純化處理，以人參皂苷Re為對照品做校正曲線，線性關系良好，標準曲線為：y=0.001 6x+0.071 9（R2=0.998 6，n=5），加樣回收率為 98.62%，RSD=1.66%，精密度，重復性好，可作為保健食品中總皂苷測定的方法，對保健品質量的控制具有重要的意義。

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