超聲波輔助提取新疆阿魏菇蛋白質工藝優化

牛博楠，許程劍，劉冰，何月，王思月

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

阿魏菇（Pleurotus ferulae）是新疆特有的菌類，其因寄生或腐生在中藥阿魏肥大的根莖部而得名。在我國阿魏菇僅分布于新疆荒漠地區的木壘、托里、阿勒泰、伊梨、塔城等地，與其寄主阿魏的分布是一致的[1]。阿魏菇集食用、藥用、美容于一身，營養豐富全面并且各類營養物質含量都很高[2-3]，被譽為當今食用菌“皇后”。阿魏菇菇體潔白高大，肉質細膩鮮嫩，味美可口，營養豐富，其蛋白質含量占干菇的20%，含有18種氨基酸，人體8種必需氨基酸全部具備。其除含有豐富的蛋白質、多糖、脂肪酸外，還含有豐富的維生素（主要含VD）、食用纖維，并富含鈣、鐵、鋅、錳等多種礦質元素和微量元素。阿魏菇還在抗腫瘤，抗疲勞，抗誘變，免疫調節[3-5]等各方面都有良好的開發利用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿魏菇（新疆清河）；牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、無水乙醇、磷酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸 均為分析純。

KQ-200VDE雙頻數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV759紫外可見分光光度器：上海精科；BS2000電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；LG100B鼓風干燥箱：上海實驗儀器廠；Neofuge15R臺式高速冷凍離心機：香港力康；打漿機。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質標準曲線的繪制

用牛血清蛋白（BSA）為標準品，運用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，繪制蛋白質標準曲線。

1.2.2 阿魏菇蛋白提取的工藝流程

新鮮阿魏菇——洗凈切片——打漿——超聲波浸提——離心——上清液考馬斯亮藍法測定蛋白含量

1.2.2.1 阿魏菇

選擇成熟適當，菇體潔白，新鮮無異味的阿魏菇，清洗后切片，用保鮮膜包裹后存放于4℃冰箱中。

1.2.2.2 打漿

稱取適當阿魏菇，用剪刀剪碎，加入等質量的蒸餾水，打漿3 min。

1.2.2.3 離心

將浸提后的漿體以7 000 r/min下離心15 min。

1.2.3 阿魏菇總蛋白含量的測定

參照GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》，運用凱氏定氮法測定阿魏菇中蛋白的含量。

1.2.4 提取工藝

1.2.4.1 單因素試驗

選擇影響蛋白得率的幾個因素：超聲溫度（20、25、30、35、40、45、50 ℃）、液料比（2、3、4、5、6 mL/g）、超聲 時 間（2、5、10、15、20 min）、pH（9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13）進行單因素試驗，分別考察各因素對阿魏菇蛋白得率的影響。

1.2.4.2 響應面優化試驗

在單因素的基礎上，選取對阿魏菇蛋白得率影響大的3個因素，采用響應面分析軟件Design-Expert.8.05建立三因素五水平的Central Composite模型，通過試驗確定最優提取工藝。變量因素編碼及水平見表1。

表1 響應面自變量因素編碼及水平Table 1 Factors and levels in response surface test

1.2.5 阿魏菇蛋白等電點的測定

將堿溶的上清液的 pH 分別調到 2.5、3、3.5、4、4.5、5，靜置30 min，離心，測定上清液蛋白含量，蛋白含量最少的即為阿魏菇蛋白的等電點。

2 結果與分析

2.1 蛋白含量測定的標準曲線

運用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，以BSA為標品，繪制蛋白質的標準曲線如圖1所示，建立的回歸方程為y=0.007 8x+0.017 7，其中y為595 nm處測得的吸光度，x為BSA 的濃度（μg/mL），R2=0.998 4。

圖1 蛋白含量測定的標準曲線Fig.1 The standard curve of protein content

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 超聲波溫度對阿魏菇蛋白提取率的影響

在pH為9，超聲時間為30 min，液料比為4 mL/g，超聲溫度對阿魏菇蛋白提取率的影響如圖2所示。

圖2 超聲溫度對阿魏菇蛋白提取率的影響Fig.2 Influence of ultrasonic temperature on Pleurotus ferulae protein extraction ratio

從圖2可以看出，阿魏菇蛋白的得率隨著超聲溫度的提高呈上升趨勢，在溫度30℃時提取率達到最大11.093%，超聲溫度繼續升高時，阿魏菇提取率呈明顯的下降趨勢，可能是由于蛋白質在高于30℃后容易受熱導致變性，使有些已水解的蛋白質發生交聯和聚合，反而降低蛋白的溶解度[6]。

2.2.2 液料比對阿魏菇蛋白提取率的影響

在超聲溫度30℃，超聲時間30 min，pH9，液料比對阿魏菇蛋白提取率的影響如圖3所示。

圖3 液料比對阿魏菇蛋白提取率的影響Fig.3 Influence of Liquid ratio on Pleurotus ferulae protein extraction ratio

如圖3所示，隨著液料比的增大，阿魏菇蛋白提取率呈上升趨勢，在液料比為4 mL/g時達到最大11.733%，當液料比繼續增大時，蛋白提取率趨于穩定。過大的液料比增加水的用量和后續濃縮難度[7]，選擇最適液料比為4 mL/g。

2.2.3 超聲時間對阿魏菇蛋白提取率的影響

在超聲溫度30℃，液料比4 mL/g，pH9，超聲時間對阿魏菇蛋白提取率的影響如圖4所示。

圖4 超聲時間對阿魏菇蛋白提取率的影響Fig.4 Influence of ultrasonic time on Pleurotus ferulae protein extraction ratio

由圖4可知，阿魏菇蛋白提取率隨著超聲時間的延長而增大，當時間到達10 min時提取率率達到最大為15.638%，當超聲時間繼續增加時，提取率明顯降低，可能是由于長時間超聲空化作用導致蛋白變性[8]，使提取率降低。

2.2.4 pH對阿魏菇蛋白提取率的影響

在超聲溫度30℃，超聲時間10min，液料比4mL/g，pH對阿魏菇蛋白提取率的影響如圖5所示。

圖5 pH對阿魏菇蛋白提取率的影響Fig.5 Influence of pH on Pleurotus ferulae protein extraction ratio

圖5可以看出，阿魏菇蛋白的提取率隨著pH的增大而增大，當pH到達10時出現了第一個高峰，隨著pH的繼續增大，蛋白提取率呈下降趨勢，之后又有緩慢的上升趨勢。但pH由12再繼續增大時，蛋白提取率增大明顯。但考慮到隨著pH的增大，氨基酸之間有可能發生縮合反應產生異味[9]使蛋白變性，綜合考慮，選擇最適pH為10。

2.3 阿魏菇蛋白等電點的測定結果

上清液中蛋白含量越少表明沉降的蛋白量越多，由圖6可以看出，阿魏菇蛋白的等電點為pH4。

圖6 阿魏菇蛋白等電點的精確測定Fig.6 The accurate determination of isoelectric point on Pleurotus ferulae protein

2.4 響應面優化分析

表2 工藝參數響應面實驗設計與結果Table 2 Design and results in response surface test of process parameters

表3 蛋白質提取率回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance to the extraction ratio of protein

對表2中的實驗數據進行多元回歸擬合[9]，得到了阿魏菇蛋白提取率對超聲溫度（A）、超聲時間（B）、液料比（C）的二次多項式的回歸模型如下：

得率=16.91-0.034A-0.94B+0.83C-0.29AB-0.47AC-0.75BC-1.50A2-1.42B2-0.59C2

由表3中的回歸模型的方差分析可知，模型的P＜0.000 1，失擬項的 P=0.216 3＞0.05，不顯著，表明建立的該模型可以用來分析和預測阿魏菇蛋白提取的工藝參數。同時由表3中的回歸模型顯著性分析可知，B、C、AC、BC、A2、B2、C2對阿魏菇蛋白得率的影響顯著，A、AB對阿魏菇蛋白得率的影響不顯著。

由圖8可得，等高線圖呈橢圓形，說明超聲時間和液料比之間的交互作用顯著，由超聲時間和液料比的3D圖可看出，阿魏菇蛋白提取率隨液料比變化的坡度較陡，彼此之間的交互作用較顯著，與回歸模型的方差分析結果相符。

由圖9可得，超聲溫度和液料比的等高線圖呈橢圓形，說明兩者之間的交互作用較顯著，并且由超溫度和液料比的3D圖可知，阿魏菇蛋白提取率隨液料比變化的坡度較陡，液料比對其影響較大，兩者之間的交互作用較顯著。

2.5 響應面結果驗證試驗

圖7 時間與溫度互作用等高線和響應面圖Fig.7 Curved surface chart of time and temperature

圖8 時間與液料比互作用等高線和響應面圖Fig.8 Curved surface chart of time and liquid to solid ratio

圖9 溫度與液料比互作用等高線和響應面圖Fig.9 Curved surface chart of temperature and liquid to solid ratio

由模型方程計算可得，阿魏菇蛋白提取率的最優實驗方案為pH10、超聲溫度27.09℃、超聲時間9.45 min、液料比5mL/g，在此條件下的蛋白提取率的理論值達到17.68%。根據試驗的實際情況將實驗條件調整為pH10、超聲溫度27℃、超聲時間10min、液料比5mL/g，重復試驗3次，最終得到的阿魏菇蛋白提取率的平均值為17.59%，與理論值基本一致。結果表明，該模型可以較好地反映出阿魏菇蛋白提取的條件，從而也證明了響應曲面法優化提取阿魏菇蛋白條件參數的可行性。

3 結論

采用Central Composite設計，建立了超聲波輔助堿溶酸沉法提取阿魏菇中蛋白質工藝參數的二次多項式數學模型，經驗證該模型是合理可靠的，能夠較好地預測阿魏菇蛋白的提取率。阿魏菇蛋白提取的優化工藝條件為pH10、超聲溫度27℃、超聲時間10 min、液料比5 mL/g，提取率達到17.59%。

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