2株纖維素降解細菌處理白酒丟糟的應用特性

游玲，周黎軍，羅剛，陳思慧，王濤

（1.生物技術(shù)與產(chǎn)業(yè)研究院，四川宜賓644007；2.宜賓職業(yè)技術(shù)學院，四川宜賓644007；3.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓644007）

白酒丟糟是白酒釀造的主要副產(chǎn)物，每生產(chǎn)1 t白酒就可產(chǎn)生2.5 t丟糟[1]，丟糟含水量高，酸度大，不易保存，易腐敗變質(zhì)，污染環(huán)境，同時含有部分淀粉（10%左右）、粗纖維（20%左右）、粗蛋白（7%～9%）、氨基酸、有機酸、低碳糖、雜醇等豐富的有機成分，是一種傳統(tǒng)的輔助飼料，一個年產(chǎn)萬噸的白酒廠可生產(chǎn)丟糟飼料7 000 t[2]。同時隨著丟糟產(chǎn)量的增加和工業(yè)上對飼料質(zhì)量要求的提高，鮮丟糟直接用于飼料的做法已不現(xiàn)實，如果采用能有效降解丟糟纖維素、能大量繁殖且蛋白質(zhì)可利用率高的菌株，對丟糟進行再發(fā)酵，轉(zhuǎn)化丟糟為高蛋白飼料，可在不增加投入的情況下，大大提高丟糟的利用效率。

目前國內(nèi)主要用于生產(chǎn)菌體蛋白的微生物有曲霉菌、根霉菌、假絲酵母菌、乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、枯草桿菌、賴氨酸產(chǎn)生菌、擬內(nèi)孢霉、白地霉等[3-4]。但這些菌株通常在白酒丟糟中生長不良，在前期研究中，本課題組對分離自530株細菌分解纖維素的能力測試，發(fā)現(xiàn)宜賓濃香型白酒產(chǎn)區(qū)廣泛分布的芽孢桿菌屬細菌有很好的分解纖維素能力[5]。本研究擬對篩選到的2株對纖維素分解力最強的細菌進行應用研究，探索在較粗放條件下細菌發(fā)酵生產(chǎn)丟糟飼料的可行性及可控的工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

白酒丟糟：宜賓敘府酒業(yè)公司提供。

保存于發(fā)酵資源與應用四川省高校重點實驗室的2株分解纖維素能力較強的兩株細菌，分別編號S522B-41、G7B-58，經(jīng) 16S rDNA特征序列分析，S522B-41菌株被初步鑒定為Bacillus safensis，G7B-58菌株被鑒定為Bacillus cereus。

1.2 菌種活化及耐受性測試

菌株接種于NA液體培養(yǎng)基（滅菌后添加無菌的HCl調(diào)節(jié)pH至4.0）中，40℃、90 r/min培養(yǎng)。每3小時測量培養(yǎng)液OD值（440 nm），繪制生長曲線。

1.3 菌株降解纖維素能力測試

2株菌的NA培養(yǎng)基菌懸液用無菌水調(diào)節(jié)至大致一致（OD440nm0.5左右）后，分別將 S522B-41、G7B-58及2株菌等比例混合后的菌懸液各200 mL添加到無菌塑料袋盛裝的5 kg丟糟中，封閉袋口，室溫（25℃～28 ℃）自然發(fā)酵，分別在第 0、2、4、6、8 天測丟糟纖維素、蛋白質(zhì)、水分、淀粉、還原糖及酸度，以未接種菌懸液的丟糟為空白對照。

按照同樣的接種方式，分別接種100、200、400 mL菌懸液于10 kg丟糟中，室溫下覆膜堆積處理8 d，在第 0、2、4、6、8 天測試丟糟纖維素含量。

1.4 分析檢測方法

纖維素及蛋白質(zhì)含量分別參考文獻[6-7]進行。水分、酸度、殘淀和殘?zhí)菣z測按參考文獻[8]進行。

2 結(jié)果分析

2.1 纖維素分解細菌對丟糟環(huán)境的適應性

2株細菌在丟糟中的生長情況見圖1。

圖1 S522B-41、G7B-58菌株的生長情況（40℃，pH 4.0）Fig.1 Growth of S522B-41 and G7B-58 in the medium of pH 4.0 under 40℃

接種丟糟0～6 h內(nèi)2株菌均有明顯的生長停滯現(xiàn)象，但整個生長過程呈現(xiàn)出波動上升的趨勢，到24 h時其上升趨勢已非常明顯，表明高溫高酸的環(huán)境條件對2株菌生長有一定影響，但兩株菌經(jīng)短暫適應期后均可在丟糟內(nèi)正常生長繁殖，可用于白酒丟糟處理。

2.2 菌株組合篩選

菌株組合篩選如圖2所示。

圖2 G7B-58、S522B-41對丟糟纖維素的降解（4%接種量）Fig.2 Cellulose-degradation of waste distiller's grains inoculated with 4%suspension of G7B-58 and（or）S522B-41

與空白相比，纖維素分解細菌G7B-58、S522B-41可明顯降低丟糟纖維素含量，分別處理丟糟8 d后可使丟糟纖維素含量由26.84%降低到22.31%及22.39%，其降解率分別達到16.9%及16.6%，兩株菌混合處理丟糟后丟糟纖維素含量可降低至21.02%，降低了21.7%，體現(xiàn)了一定的加合作用，且該加合作用在延長處理時間（6 d以上）時尤為明顯，考慮到生產(chǎn)實踐中，長時間堆積將會影響到場地使用效率，而且混菌處理較單菌株處理復雜，可控性也較差，因此，單菌株更適宜丟糟短時處理。

如圖3所示，G7B-58、S522B-41可顯著提高丟糟蛋白含量，兩株菌分別處理丟糟8 d后可使丟糟蛋白質(zhì)含量從8.96%提高到為12.10%及12.47%，提高了35.0%及39.2%，兩株菌混合處理丟糟可使丟糟蛋白含量達到12.64%，提高了41.1%，可見這兩株細菌可明顯促進丟糟蛋白質(zhì)含量的增加。總體上，S522B-41菌株產(chǎn)蛋白的能力明顯好于G7B-58菌株，但兩株菌降解纖維素的能力相差不大，說明S522B-41菌株可能除利用纖維素外，還可能可以利用丟糟中的其他碳源積累菌體蛋白，如少量淀粉、殘?zhí)巧踔劣袡C酸等，其對丟糟物質(zhì)的轉(zhuǎn)化效果總體上G7B-58菌株，兩株菌混合處理在積累菌體蛋白，增大丟糟蛋白質(zhì)含量方面也不存在明顯加合作用，結(jié)合考慮工藝復雜性等因素，利用單菌株處理丟糟比混菌處理更為可行。

圖3 G7B-58、S522B-41對丟糟蛋白質(zhì)含量的影響（4%接種量）Fig.3 Protein content of waste distiller's grains inoculated with 4%suspension of G7B-58 and（or）S522B-41

2.3 接種量對丟糟處理效果的影響

接種量對處理效果的影響見表1。

表1 不同接種量對丟糟成分變化的影響Table 1 Components of waste distiller's grains inoculated with different inoculum of G7B-58 or S522B-41

增大接種量意味著起始時接入更多菌體，理論上可縮短菌體細胞在丟糟環(huán)境中的適應期，但菌懸液帶入的水分也會增加工藝難度。從表1可以看出，接種量對丟糟水分變化、纖維素降解率、蛋白質(zhì)增量影響不大，對淀粉及還原糖的含量變化有明顯影響，對丟糟酸度變化有顯著影響。

處理8 d后，接種1%的S522B-41菌懸液可增大丟糟酸度，接種2%的S522B-41菌懸液時丟糟酸度降低最為明顯，達81.6%，同時菌株對丟糟中的淀粉、殘?zhí)恰⒗w維素的消耗明顯增加，其蛋白含量也增加最多，但進一步增大接種量到4%，其降酸及利用纖維素的效果反而較差，可能是由于接種量過大導致菌體在相對貧瘠的丟糟營養(yǎng)環(huán)境中由于相互競爭生長不良。

對G7B-58菌株來說，也有類似現(xiàn)象，2%及4%的接種量下，該菌株降解丟糟纖維素及積累蛋白的效果差異不大，但2%接種量下，菌株降低丟糟酸度，利用淀粉或殘?zhí)堑男Ч谩Ｒ虼耍覀冋J為兩株菌處理丟糟的接種量均以2%（菌懸液濃度控制在OD440nm=0.5～0.6）為宜。

2.4 處理時間對丟糟處理效果的影響

兩株細菌的菌懸液按2%接種量接入10 kg丟糟后，2 d內(nèi)菌體即大量增殖，體現(xiàn)為丟糟蛋白含量上升最快，4 d后其含量漸趨于穩(wěn)定（圖3），同時丟糟纖維素含量持續(xù)下降。懸液接種丟糟后，2 d～3 d內(nèi)即可完成菌體增殖，表明菌體增殖所需碳源并非來自丟糟纖維素的降解，也就是說丟糟纖維素降解與丟糟蛋白積累之間不存在明顯的因果關(guān)系，菌體生長不僅導致丟糟中纖維素、蛋白質(zhì)含量下降，對丟糟中其余組分也有一定影響（圖4～圖7）。

圖4 細菌處理丟糟后丟糟水分含量變化趨勢Fig.4 Moisture trend of waste distiller's grains inoculated with G7B-58 or S522B-41

圖5 細菌處理丟糟后丟糟酸度變化趨勢Fig.5 Acidity trend of waste distiller's grains inoculated with G7B-58 or S522B-41

圖6 細菌處理丟糟后丟糟淀粉含量變化趨勢Fig.6 Starch content trend of waste distiller's grains inoculated with G7B-58 or S522B-41

總體上，菌懸液生長可使丟糟水分含量略微上升，如圖4所示，S522B-41可使丟糟水分含量上升1.3%，G7B-58可使丟糟水分含量上升1.6%后隨即下降，最終使水分含量上升2.5%，扣除水分自然蒸發(fā)量，新增加的水大部分由細菌代謝產(chǎn)生，表明丟糟內(nèi)存在旺盛的細菌代謝，且兩株菌的代謝情況有一定差異，由于對多種碳源的優(yōu)先利用不同，G7B-58菌株可能存在兩個代謝高峰。

兩株菌對丟糟酸度的影響如圖5所示，接種菌株后丟糟酸度在第4天左右均有明顯上升，但隨即明顯降低，如G7B-58菌株處理丟糟后丟糟酸度在6 d后趨于穩(wěn)定，對S522B-41菌株來說，處理8 d后仍有繼續(xù)降低的趨勢。總體上，S522B-41菌株降低丟糟酸度的效果更好。

細菌對丟糟的中淀粉含量的影響主要是對淀粉的利用，同時還可以通過分解纖維素，使被纖維素包裹的淀粉釋放出來從而增加丟糟中淀粉含量，但總體上丟糟淀粉在細菌作用下明顯降低，兩株菌對丟糟淀粉含量的影響見圖6，接種前2天變化幅度較小，兩株菌分別從第2天（S522B-41）、第 4天（G7B-58）開始大量利用丟糟中的淀粉，到接種6 d時趨于穩(wěn)定，推測剩余淀粉在纖維素含量不繼續(xù)降低的情況下已很難被利用。

在丟糟環(huán)境中，影響還原糖含量的主要因素包括菌株對糖的消耗及淀粉、纖維素的分解導致還原糖含量上升，兩株菌對丟糟含糖量的影響見圖7。

圖7 細菌處理丟糟后丟糟還原糖含量變化趨勢Fig.7 Reducing sugar content trend of waste distiller's grains inoculated with G7B-58 or S522B-41

對S522B-41菌株，0～2 d內(nèi)丟糟含糖量明顯上升，可能是由淀粉分解所致（這與該時間段內(nèi)丟糟內(nèi)淀粉開始降解的現(xiàn)象一致），2 d后，還原糖含量迅速降低，到第4d已趨近于零，隨后又由于淀粉或纖維素的分解而略有上升，到第6天趨于穩(wěn)定。而G7B-58菌株在接種后的前兩天首先消耗丟糟中的殘?zhí)牵? d內(nèi)就已經(jīng)消耗掉大部分殘?zhí)牵S即開始分解淀粉或纖維素，導致還原糖含量上升，隨后又因生長消耗掉大部分還原糖。雖然最終兩株菌處理丟糟后均可使丟糟的還原糖含量降至0.1%以下，但在丟糟環(huán)境內(nèi)，S522B-41菌株及G7B-58菌株對糖、淀粉或纖維素的利用優(yōu)先順序和難易程度有所不同，從充分利用丟糟碳源的角度來看，S522B-41菌株優(yōu)于G7B-58菌株。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對G7B-58、S522B-41降解丟糟纖維素特性的應用研究，發(fā)現(xiàn)這兩株菌均可適應丟糟堆積的酸度及溫度，僅在室溫下噴灑丟糟后簡單堆積，不添加任何輔料，就可使丟糟纖維素分別降低16.9%及16.6%，蛋白質(zhì)含量分別增加35.0%及39.2%，兩株菌混合使用時丟糟纖維素降解21.1%，蛋白增加41.1%，同時降低丟糟酸度達86%。在10 kg的堆積規(guī)模下，這兩株細菌處理丟糟均以2%接種量，堆積6 d為宜，在實際生產(chǎn)中，丟糟量遠大于該實驗規(guī)模，堆內(nèi)溫度更高，可適當降低接種量，采用每層噴灑方式接種。

關(guān)于白酒丟糟微生物處理的研究，近二十年來已有大量報道，一般的思路是利用霉菌、酵母酵母的組合菌劑對丟糟進行處理，一般需在丟糟中添加多種營養(yǎng)物質(zhì)，或者調(diào)節(jié)丟糟pH，其接種量也較大[9-11]，而白酒丟糟產(chǎn)量巨大，上述處理方式相對較為復雜，在丟糟無害化處理或丟糟飼料生產(chǎn)時，工藝的復雜程度直接影響技術(shù)的推廣，本研究采用產(chǎn)芽孢細菌菌懸液以較小接種量（2%）直接噴灑丟糟，不用添加其他營養(yǎng)物質(zhì)，接種2 d內(nèi)即可完成菌體增殖，6 d內(nèi)即可達到較好的處理效果，處理方式簡便粗放，更適宜中小企業(yè)。同時，宜賓濃香型白酒產(chǎn)區(qū)丟糟的蛋白含量僅為8.96%，而北方地區(qū)的酒糟蛋白含量可達17%～24%[4]，更適宜細菌生長，該菌株在北方酒企的應用效果將更好。

[1] 王貞富.白酒廠酒糟的利用[J].釀酒,1999,26(3):32-34

[2] 王肇穎,肖敏.白酒酒糟的綜合利用及其發(fā)展前景[J].釀酒科技,2004,25(1):65-67,64

[3] 侯文華,李政一,楊力,等.利用酒糟生產(chǎn)飼料蛋白的菌種選育[J].環(huán)境科學,1999,20(1):77-79

[4] 張博潤,劉偉平,劉玉方,等.發(fā)酵白酒糟生產(chǎn)飼料蛋白的優(yōu)良菌種的篩選[J].微生物學報,1997,37(2):130-134

[5] 王怡,何奉芹,羅琳,等.釀造細菌分解纖維素的初步研究[J].中國釀造,2011,30(12):77-80

[6] 吳國峰,李國全,馬永強.工業(yè)發(fā)酵分析[M].北京:化學工業(yè)出版社,2006:4-36

[7] 李樹明,黃治國,羅惠波,等.白酒丟糟發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料的菌種篩選[J].西南大學學報:自然科學版,2011,33(10):27-30

[8] 沈怡方.白酒生產(chǎn)技術(shù)研究[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1998

[9] 張博潤,劉玉方,何秀萍,等.發(fā)酵白酒糟生產(chǎn)飼料蛋白的培養(yǎng)條件及產(chǎn)物分析[J].微生物學報,1997,37(4):281-285

[10]劉達玉,黃丹,夏兵兵,等.組合菌種發(fā)酵制備酒糟飼料的研究[J].四川理工學院學報:自然科學版,2008(6):68-70

[11]程馳,周健,羅惠波.高效丟糟纖維素分解菌的篩選及產(chǎn)酶研究[J].釀酒科技,2012,33(6):96-98