ERCC1和Survivin預測96例NSCLC化療療效*

于 英，何 朗，郭翠華，潘榮強

(川北醫學院第二臨床醫學院·四川省南充市中心醫院，四川 南充 637000)

以鉑類為基礎的化療方案在晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的治療中雖占據著重要地位，但療效已達平臺期。報道已初步證實一些腫瘤分子指標的變化與化療療效及鉑類耐藥密切相關。剪切修復偶聯因子1(ERCC1)是核苷酸外切修復家族中的重要成員，也是核苷酸切除修復(NER)途徑的關鍵基因，它是人類第一個被克隆的NER因子，在核酸損傷修復過程中起著重要作用。存活蛋白(Survivin)屬于凋亡抑制蛋白(IAP)家族，是迄今發現的最強的凋亡抑制因子之一。目前多認為Survivin是一個雙功能蛋白，除抑制凋亡外，還參與有絲分裂調節和新生血管形成。我們通過檢測 ERCC1和 Survivin在NSCLC中的表達，以初步探索兩者對化療療效的預測價值，從而為臨床用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2007年12月～2010年12月在川北醫學院第二臨床醫學院住院的96例初治晚期NSCLC患者，均有明確病理學診斷，男性68例，女性28例;年齡37歲～82歲，中位年齡60歲，＜60歲39例，≥60歲57例;吸煙者63例，非吸煙者33例;依據2003年WHO肺癌的組織學分類標準分為鱗癌41例，腺癌44例，腺鱗癌11例，高和中分化癌45例，低分化癌51例;按1997年肺癌的UICC分期標準分為ⅢB期33例，Ⅳ期63例;周圍型肺癌有67例，中央型29例。電話隨訪其生存狀況，隨訪率為100%。入組前未接受化放療，PS≤2，預計生存期＞3月，無化療禁忌，簽署知情同意書，依從性好。有精神病史、其他惡性腫瘤史及嚴重或未控的內科疾患或感染者排除。所有患者行含鉑化療方案化療至少2周期，2周期后評價療效。

1.2 化療方法

化療方案分別為紫杉醇+順鉑(紫杉醇135mg/m2，d1;順鉑 75mg/m2，d1)、長春瑞濱 + 順鉑(長春瑞濱25mg/m2，d1、8;順鉑 75mg/m2，d1)和吉西他濱+順鉑(吉西他濱1000 mg/m2，d1、8;順鉑75mg/m2，d1)，化療2周期后評價療效并隨訪其1年生存狀況。

1.3 實驗方法

1.3.1 主要抗體及試劑 鼠抗人ERCC1單克隆抗體(ZMED公司，產品編號ZM-0138);第二代即用型免疫組化ElivisionTMplus廣譜試劑盒(福建邁新生物技術公司):包括試劑A(增強劑)和試劑B(酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物)。兔抗人Survivin多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術公司，產品編號ZA-0458);PV-6000通用二步法免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司)。

1.3.2 免疫組化染色 本實驗采用IHC進行ERCC1及Survivin的檢測，預實驗得出ERCC1最佳IHC方法為兩步法(Elivision，過夜)，抗原修復方式為枸櫞酸高壓鍋修復，工作濃度1∶50;Survivin為兩步法(Envision，過夜)，抗原修復方式為EDTA高壓鍋修復，工作濃度1∶100。ERCC1的陽性對照采用強陽性表達組織扁桃體，著色為細胞核;Survivin的陽性對照組織為乳腺癌組織，為胞漿和/或胞核內顆粒積聚。

1.4 結果評價標準

1.4.1 IHC結果判定標準 ERCC1主要呈細胞核染色，染色結果的判定參照Wachters［1］提出的評判標準，即在高倍視野(×400)下隨機計數300個腫瘤細胞，如果該高倍視野內腫瘤細胞小于300，則至少應該大于150，當計數腫瘤細胞核不染色或染色陽性細胞數＜10.0%時則判定為陰性表達(-);視野中核染色陽性細胞數﹥10.0%時則判定為陽性表達(+)。Survivin著色于胞漿和/或胞核內，依據Tanaka［2］的評判標準:H=N×I。H ﹥1為陽性，H≤1則為陰性。陽性細胞數記分(N)為5個高倍視野陽性細胞數的百分率。共分5個等級:0分，＜5.0%;1 分，5.0% ～ 25.0%;2 分，25.0% ～50.0%;3 分，50.0% ～75.0%;4 分，＞75.0%。著色強度記分(I)為:1分，弱陽性(+);2分，中度陽性(++);3分，強陽性(+++)。

1.4.2 化療療效評價標準 參照WHO實體瘤療效評定標準:完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、無變化(NC)和進展(PD)。以(CR+PR)數/病例總數為化療有效率(RR)。

1.5 統計分析

采用SPSS17.0軟件進行統計學分析。率的比較采用χ2檢驗;生存分析用Kaplan-Meier法，采用Log-rank法檢驗;利用COX比例風險回歸模型探討研究因素與預后之間的關系，并估計出相對危險度。

2 結果

2.1 ERCC1、Survivin在 NSCLC 中的表達

ERCC1主要在細胞核中表達，表現為棕黃色顆粒;Survivin主要呈胞漿和/或胞核著色。96例NSCLC中ERCC1陽性率為58.3%(56/96)，陰性率為41.7%(40/96);Survivin 陽性率為 76.0%(73/96)，陰性率為24.0%(23/96)。見圖1，2。

2.2 ERCC1、Survivin 預測近期療效

96例NSCLC患者中，ERCC1陽性組患者CR 0例，PR 13例，其化療有效率為23.2%(13/56);ERCC1陰性組患者CR 1例，PR 21例，化療有效率為55.0%(22/40)，ERCC1陰性組化療有效率高于陽性組(Ρ＜0.05)。Survivin陽性組患者CR 1例，PR 24例，其化療有效率為34.2%(25/73);陰性組患者CR 0例，PR 10例，化療有效率為43.5%(10/23)，Survivin陰性組化療有效率高于陽性組，但差異沒有統計學意義(Ρ＞0.05)。(表1)

圖1 ERCC1在中分化肺鱗癌胞核中的陽性表達(Elivision，×400)Figure1 The positive expression of ERCC1 in nucleus of moderately differentiated squamous cell carcinoma of lung(Elivision，×400)

圖2 Survivin在中分化肺腺鱗癌胞漿中陽性表達(Envision，×400)Figure 2 The positive expression of Survivin in cytoplasm of moderately differentiated adenosquamous carcinoma of lung(Envision，×400)

表1 ERCC1、Survivin陽性組和陰性組化療療效的比較Table 1 The comparison of efficacy of Chemotherapy between positive and negative group of ERCC1/Survivin in NSCLC

2.3 ERCC1、Survivin 與生存的關系

隨訪1年后64例患者死亡。ERCC1陽性組和陰性組1年生存率差異有統計學意義(χ2=6.715，P=0.010)。見圖3。Survivin陽性組和陰性組1年生存率比較，差異無統計學意義(χ2=1.455，Ρ =0.228)。見圖4。

圖3 ERCC1不同表達組的生存曲線Figure 3 The survival curve of positive and negative group of ERCC1 in NSCLC

圖4 Survivin不同表達組的生存曲線Figure 4 The survival curve of positive and negative group of Survivin in NSCLC

2.4 ERCC1、Survivin與患者臨床特征間關系

96例NSCLC腫瘤組織中，ERCC1表達狀態與患者性別、年齡、吸煙、病理類型、分化程度、腫瘤部位等因素并無明確關系(Ρ＞0.05)，但Ⅳ期患者ERCC1表達率要高于ⅢB期患者(Ρ=0.010)(表2)。Survivin表達與性別、年齡、吸煙、病理類型、臨床分期、腫瘤部位等因素亦無明顯相關性(Ρ＞0.05)，但高-中分化組別Survivin陽性率顯著高于低分化組(Ρ =0.030)(表3)。

表2 ERCC1的表達與NSCLC臨床特點的關系Table 2 The relationship between ERCC1 and the clinical characteristic of NSCLC

表3 Survivin的表達與NSCLC臨床特點的關系Table 3 The relationship between Survivin and the clinical characteristic of NSCLC

2.5 COX回歸模型分析多因素與患者預后的意義

我們將病理類型、分化程度、臨床分期、腫瘤部位、性別、年齡、吸煙史、ERCC1表達、Survivin表達狀態等進行多因素COX模型回歸分析。最后被納入模型且有統計學意義的影響因素為ERCC1表達狀態，ERCC1陽性患者的死亡風險是陰性患者的3.390倍，而其余影響因素包括Survivin表達狀態均顯示與預后無關。

表4 Cox回歸風險模型Table 4 Cox regression model

3 討論

ERCC1主要在細胞核中表達，陽性產物為棕黃色顆粒，它在核酸損傷修復和凋亡過程中起重要作用，是人類第一個被克隆的核苷酸剪切修復(NER)因子，它與腫瘤的發生和起源關系密切。本試驗發現96例NSCLC腫瘤組織中ERCC1陽性率較高，為58.3%(56/96)，與國外相關文獻報道［3-4］類似，支持ERCC1可能與NSCLC的發病相關。Survivin主要呈胞漿和/或胞核著色，是迄今發現最強的凋亡抑制因子之一，屬凋亡抑制蛋白(IAP)家族。研究表明，Survivin在大多數腫瘤組織中表達而在成人正常組織一般不表達或低表達［5-6］。本實驗發現Survivin 陽性率為76.0%(73/96)，陰性率為24.0%(23/96)，在 NSCLC 腫瘤組織中高表達，支持 Li［5］和 Akyürek［6］的報道，說明 Survivin 也可能與腫瘤的發生相關，且其染色部位集中于腫瘤的細胞核和細胞漿。

含鉑方案化療對于術后或晚期NSCLC患者而言雖然是有益的［7］，但其療效并不理想。本研究結果顯示，ERCC1陰性組化療有效率優于陽性組(55.0%VS 23.2%，Ρ ＜0.05)，這與 Olaussen［8］的試驗結果一致，說明ERCC1的表達與療效間關系可能為負相關。分析原因，鉑類藥物主要通過損傷腫瘤細胞DNA發揮作用，核酸損傷修復增強是鉑類耐藥的主要原因之一，對鉑類藥物的抵抗與ERCC1的過表達有關［8］，故ERCC1缺乏的細胞不能進行鉑類-DNA加合物的修復，對化療相對敏感。因此，ERCC1的表達可考慮用于預測鉑類化療方案的療效，高水平表達者化療療效差，反之低水平者療效較好。Survivin與腫瘤的耐藥有密切關系，腫瘤耐藥常伴隨著Survivin在腫瘤組織和細胞系中的高表達，抑制Survivin的表達有可能降低細胞的耐藥性，從而產生較好的化療療效［9］。也就是說，相對 Survivin高表達狀態，低表達者可能有著更高的化療有效率。我們的研究雖不能明確支持這一觀點，但Survivin陰性組有效率卻有著遠高于陽性組的趨勢(43.5%VS 34.2%，Ρ ＞0.05)，相信擴大樣本量試驗可能會得到更準確的結果。

單因素分析發現，Ⅳ期患者ERCC1表達率要高于ⅢB期患者，高-中分化癌的腫瘤患者Survivin表達明顯高于低分化組(Ρ＜0.05);同樣，更多的證據支持兩者的表達程度與患者的生存呈負相關［10-11］，多因素分析亦支持這一觀點。本試驗提示ERCC1陽性患者的死亡風險明顯高于陰性患者，進一步生存分析發現，ERCC 1陰性組和陽性組的1年生存率差異有統計學意義(P=0.010)。因此，ERCC1可考慮作為晚期NSCLC生存預測的指標，ERCC1陰性組的1年生存率更高。生存曲線還發現，Survivin陽性組和陰性組的1年生存率比較差異并無統計學意義(Ρ=0.228)，說明Survivin表達狀態可能與患者的生存預后無關［12］，我們的研究結果與前述觀點不符，分析原因可能與我們的病例中IV期病例過多，樣本量較小，樣本來源和試驗方法的不同等相關，進一步的前瞻性大樣本試驗可能會解釋這種差異。

我們的研究提示在近期療效上，ERCC1陰性組化療有效率和1年生存率均高于陽性組(Ρ＜0.05)，ERCC1與其化療療效及預后有關;Survivin陰性組化療有效率和1年生存率高于陽性組，但無統計學意義(Ρ＞0.05)。但在遠期療效評價上，ERCC1和Survivin究竟充當何種角色尚不得而知，故尚需納入多中心，大樣本標本進行長期生存隨訪以給臨床醫療提供真正有效的幫助。

［1］Wachters FM，Wong LS，Timens W，et al.ERCC1，hRad51，and BRCA1 protein expression in relation to tumour response and survival of stage III/IV NSCLC patients treated with chemotherapy［J］.Lung Cancer，2005，50(2):211-219.

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［4］Saebo M，Skjelbred CF，Nexo BA，et al..Increased mRNA expression levels of ERCC1，OGG1 and RAI in colorectal adenomas and carcinomas［J］.BMC Cancer，2006，16(6):208.

［5］Li F，Yang J，Ramnath N，et al.Nuclear or cytoplasmic expression of survivin:what is the significance?［J］.Int J Cancer，2005，114(4):509-512.

［6］Akyürek N，Memis L，Ekinci ?，et al.Survivin expression in preinvasive lesions and non-small cell lung carcinoma［J］.Virchows Arch，2006，449(2):164-170.

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［8］Olaussen KA，Dunant A，Fouret P，et al.DNA repair by ERCC1 in non-small-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy［see comment］［J］.N Engl J Med，2006，355(10):983-991.

［9］Ho TF，Peng YT，Chuang SM，et al.Prodigiosin down-regulates survivin to facilitate paclitaxel sensitization in human breast carcinoma cell lines［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2009，235(2):253-260.

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［12］Deng H，Wu RL，Zhou HY，et al.Significance of Survivin and PTEN expression in full lymph nodeexamined gasTric cancer［J］.World J Gastroenterol，2006，12(7):1013-1017.