PCR-DGGE結合測序在檢測混合細菌感染中的價值

黃君華，張書婉，張寧

(1.西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710021；2.西安市兒童醫院檢驗科，陜西 西安 710003；3.西安交通大學醫學院第一附屬醫院檢驗科，陜西 西安 710061)

PCR-DGGE結合測序在檢測混合細菌感染中的價值

黃君華1，張書婉2，張寧3

(1.西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710021；2.西安市兒童醫院檢驗科，陜西 西安 710003；3.西安交通大學醫學院第一附屬醫院檢驗科，陜西 西安 710061)

目的探討變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）結合測序在檢測混合細菌感染中的作用，為細菌多重感染的診斷提供新的思路。方法以3份臨床培養鑒定為混合感染的膽囊穿刺引流液為對象，提取細菌總DNA并擴增16S rDNA-V3區，后進行DGGE分析，將所得條帶切膠純化再擴增，擴增產物進行測序及BLAST比對，比較比對結果與臨床培養結果的一致性。結果DGGE可以很好地分離16S rDNA-V3區混合PCR產物，每一個擴增子的測序比對結果與臨床培養結果一致。結論PCR-DGGE結合測序的方法可以很好地鑒定臨床混合感染標本中的病原菌，可作為快速檢測方法在臨床應用。

混合細菌感染；通用引物PCR；變性梯度凝膠電泳；測序；快速檢測

混合細菌感染的發病率逐年增多[1]，而目前臨床上主要應用培養的方法檢測混合細菌感染，耗時長，檢出率低，容易出現假陰性[2]。近些年，分子生物學方法，尤其是16S rDNA PCR技術[3]，在快速檢測細菌感染方面應用廣泛，然而檢測混合細菌感染的分子生物學方法較少。本實驗應用通用引物PCR擴增細菌16S rDNA-V3區，混合的擴增子在變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，從而使長度相同但序列不同的擴增子相互分離，然后將擴增子進行回收測序和序列比對，并將比對結果與培養結果相比較，取得滿意的預期目標，為檢測混合感染提供了新的分子生物學途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料從西安交通大學醫學院第一附屬醫院肝膽外科收集3份經VITEK compact全自動細菌鑒定藥敏分析儀培養鑒定為混合細菌感染的膽囊穿刺引流液各2 ml。

1.2 方法

1.2.1 穿刺引流液細菌總DNA的提取將穿刺引流液標本離心5 min，取沉淀，應用QIAamp Blood DNA Mini Kit試劑盒(QIAGEN，Cat.No.51106)，操作步驟按照試劑盒說明書。

1.2.2 PCR擴增選擇可擴增細菌16S rDNA-V3區的通用引物擴增細菌總DNA。引物序列參照Muyzer等[4]設計，其中上游引物5'端延伸添加GC夾(GCclamps序例：GCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGG GGG)，用以提高PCR產物在DGGE中分離效率[5]。V3-F-GC：GCclamps-CCTACGGGAGGCAG，V3-R：ATTACCGCGGCTGCTGG，擴增產物大小為193 bp。50μlPCR反應體系，包括：10×buffer5μl，10mmol/LdNTP 1μl，2.5 mmol/LMgCl25μl，5μmol/LV3-F、V3-R各2μl，Taq酶(5 U/μl)0.4μl，DNA模板4μl，ddH2O 30.6μl。PCR反應程序：采用touchdown PCR[4]，即預變性95℃5 min；95℃變性1 min，退火溫度初次設定為65℃1 min，延伸65℃1 min，退火溫度每2個循環降低1℃，最后退火溫度降到55℃，在此退火溫度上再進行10個循環；72℃7 min，4℃保存。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳的電壓為6 V/cm，采用溴化乙錠(EB)染色20 min，后在凝膠成像分析系統拍照保存。

1.2.3 DGGE分析應用DcodeTM Universal Mutation檢測系統(Bio-Rad，Herchles，CA，USA)，膠板大小16 cm×10 cm×1 cm。實驗中通過反復摸索得到16S rDNA-V3區通用引物PCR擴增產物DGGE電泳的最適條件為：聚丙烯凝膠膠濃度為8%，變性梯度范圍(由上到下)為30%～65%。按照儀器使用說明將凝膠裝置在電泳系統中，在新配置的1×TAE電泳緩沖液中，以150 V電壓預電泳30 min，然后取10μl擴增產物，與6×loading buffer混勻，加入到上樣孔中，安裝好電泳系統后，即電泳：先以60 V電泳1 h，后以100 V電壓12 h，電泳溫度設置為60℃。電泳完畢后，小心地將膠放入EB溶液(終濃度為0.5 μg/ml)中染色20 min，然后在凝膠成像系統中觀察并拍照保存。用潔凈的刀片切下目的條帶，放入盛有100μl 1×TE的1.5 ml滅菌Ep管中。將盛有凝膠的Ep管放入99℃金屬浴20 min，使凝膠融化，然后以管中液體為模板，再次PCR擴增，反應體系、擴增程序如前所述，但引物為不帶GC夾的V3-F/V3-R。

1.2.4 測序比對獲得的擴增產物經純化后送上海生工生物工程有限公司測序，登陸http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，將測序結果在Gen-Bank中進行BLAST比對。

2 結果

2.1 16S rRNA-V3區通用引物擴增結果16S rRNA-V3區通用引物的擴增產物與預期片段大小(193 bp)相符合(圖1)。從結果可以看出混合細菌經通用引物擴增后僅有一種大小的產物，且混合擴增子經普通瓊脂糖電泳無法區分。

2.2 DGGE結果我們預想16S rRNA-V3區通用引物所產生的混合擴增子通過DGGE可分離開，若出現兩條條帶，說明混合PCR產物中有兩種擴增子；若出現三條條帶，說明有三種擴增子；若條帶出現在同一水平上則應為同一種病原菌。實驗結果與預想的相同(圖2)，1道有兩條條帶，臨床培養出兩種菌(糞腸球菌、陰溝腸桿菌)；2道有三條條帶，臨床培養出三種菌(糞腸球菌、屎腸球菌、產氣腸桿菌)；3道有三條條帶，臨床培養出三種菌(屎腸球菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌)。

圖1 16 S rRNA-V3區通用引物擴增結果

圖2 多重感染標本DGGE結果

2.3 DGGE圖譜切膠回收測序結果將所得到的8條條帶進行測序，得到8個測序結果，利用BLAST進行比對。從結果中可以看到，比對結果與培養結果一致，并證實圖譜上同一位置條帶為相同菌種(表1，圖2)。

表1 混合感染16S rRNA-V3區PCR-DGGE回收條帶測序結果及臨床培養結果

3 討論

DGGE是根據DNA的解鏈特性，在不同濃度的變性劑中，不同堿基組成的DNA雙螺旋的解鏈行為不同而導致其電泳遷移率發生變化，從而將片段大小相同而序列不同的DNA片段很理想地分開。DGGE主要應用在生物多樣性調查、親緣關系鑒定、基因突變檢測等領域。在微生物研究領域中，其主要應用于微生物生態學。1993年Muyzer等[4]首次將變性梯度凝膠電泳技術應用到微生態領域。該技術對微生態的分析主要包括三步：首先從微生態標本中提取所有微生物總的DNA；其次用16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增，將混合的擴增子在變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，從而使長度相同但序列不同的擴增子相互分離；最后進行DGGE指紋圖譜分析。該技術的一大優點是可以從凝膠中切下條帶,然后通過測序來鑒定菌種。不足之處在于如果不同DNA片段有相似的融點行為，則不能分離開來。為達到良好的分離效果，通常在一條通用引物的5'端連接一段長度為30～50bp富含GC的核苷酸序列，稱為GC夾(GC-clamps)，這樣可以顯著地提高分辨力。Wu等[5]應用UP-PCR擴增腸道菌群16S rRNA基因V3區，然后用DGGE進行分析，發現2型糖尿患者與正常人的腸道菌群有顯著差異。

所有原核細胞基因組DNA經16S rRNA基因通用引物擴增后，所產生的擴增子長度都是相同的，因此對于混合細菌感染，僅用通用引物PCR和測序無法對感染病原菌進行鑒定。為了鑒定混合感染中的各個病原菌種類，本實驗用DGGE對標本進行分析。首先從標本中提取所有病原菌的DNA，然后用16S rRNA基因通用引物V3-F/V3-R進行PCR擴增，得到193 bp的擴增產物，將混合的擴增子在變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳使之相互分離，最后從凝膠中切下條帶，通過測序來鑒定菌種，取得良好的效果，為多重感染標本中病原菌的分離鑒定提供了新思路。為達到良好的分離效果，提高分辨力，本實驗也用了GC夾。由培養結果、DGGE結果和測序比對結果可知，在DGGE圖譜中，同一水平位置上的條帶為一種菌(條帶1和3為糞腸球菌；條帶4和6為屎腸球菌)；兩種菌感染出現兩條條帶，三種菌感染會出現三條條帶。

混合細菌感染可發生于許多疾病，如支氣管肺炎[6]、肺結核[7]、腦膿腫、腦膜炎[8]、骨關節感染[9]、糖尿病、膽囊感染、胸腹水感染、感染性心內膜炎[10]等。目前臨床主要通過培養進行鑒定，耗時較長，假陰性率高。一些分子生物學方法，如多重PCR、熒光定量PCR[11]，檢測范圍窄，同樣會出現假陰性。本方法不僅適用于膽囊穿刺引流液，同樣適用于其他無菌部位混合感染的病原菌鑒定，后期工作需增加樣本的來源種類和數量，進一步驗證本方法的靈敏度和特異性，規范操作步驟，使其具有臨床實用性。

綜上所述，PCR-DGGE結合基因測序是一種很有前景的檢測混合細菌感染的方法，能夠達到與常規培養一致的效果。

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Value of PCR-DGGE following by sequencing for detecting mixed bacterial infection.

HUANG Jun-hua1,

ZHANG Shu-wan2,ZHANG Ning3.
1.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021, Shaanxi,CHINA;2.Clinical Laboratory,Xi'an Children's Hospital,Xi'an 710003,Shaanxi,CHINA;3.Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital,School of Medicine,Xi'an Jiaotong University,Xi'an710061,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo explore the value of PCR-DGGE and sequencing for detecting mixed bacterial infection.MethodsA total of 3 samples which has been identified mixed bacterial infection by culture were included.The bacterial DNA was extracted and amplified the 16S rDNA-V3，following by DGGE,sequencing and BLAST.Then,to compare the consistency of BLAST and cultivation.ResultsDGGE could differentiate the mixed amplicons of 16SrDNA-V3 sensationally,and the results of BLAST and cultivation were consistent.ConclusionPCR-DGGE and sequencing provide a new way to diagnose mixed bacterial infection,which might be effective for identifying the pathogen in the sample.

Mixed bacterial infection;Broad-spectrum PCR;DGGE;Sequencing;Rapid detection

R37

A

1003—6350（2014）08—1154—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.08.0447

2013-11-10)

黃君華。E-mail：huangjunhua1985@163.com