電針任督脈對局灶性腦缺血大鼠神經功能和神經細胞凋亡的影響*

穆桂萍 曾瑤池 陳鵬典 羅文舒馬曉明 熊益群 劉心亮 劉文赫

（廣州中醫藥大學附屬深圳市中醫院，廣東 深圳 518033）

電針任督脈對局灶性腦缺血大鼠神經功能和神經細胞凋亡的影響*

穆桂萍 曾瑤池 陳鵬典 羅文舒△馬曉明 熊益群 劉心亮 劉文赫

（廣州中醫藥大學附屬深圳市中醫院，廣東 深圳 518033）

目的探究電針任督脈對局灶性腦缺血模型大鼠神經功能和神經細胞凋亡的影響。方法采用線栓法制作大鼠大腦中動脈栓塞模型，利用改良的神經功能缺損評分表（mNSS）觀察治療后大鼠神經行為學變化情況，并采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）檢測其大腦皮層神經細胞凋亡情況，以及電針任督脈對其的影響。結果大鼠造模后mNSS顯著升高，且大腦皮層TUNEL陽性細胞數明顯增多；與同時期模型組比較，電針任督脈組腦缺血再灌注7 d、14 d和28 d其mNSS和TUNEL陽性細胞數明顯降低。結論電針任督脈可能通過抑制腦缺血再灌注后皮層神經細胞凋亡和改善神經功能缺損來改善腦缺血損傷。

電針任脈督脈缺血性中風細胞凋亡神經功能缺損

腦缺血再灌注損傷可造成神經元壞死，又可誘導神經元發生凋亡。因此，采取相應措施抑制神經元凋亡，可阻止腦缺血瀑布損傷的擴展，有利于患者神經功能的恢復。前期研究表明，電針任督脈經穴可持續促進腦缺血大鼠腦內神經干細胞增殖與分化，對腦缺血后神經再生具有顯著的積極效應［1-2］。基于此，本研究擬從腦缺血再灌注后神經細胞凋亡和神經功能缺損方面入手，進一步探討電針任督脈對腦缺血再灌注損傷的可能保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物和分組成年健康雄性清潔級SD大鼠54只，體質量（220±20）g，購于廣東省實驗動物中心。隨機分為假手術組、模型組和電針組，每組動物又隨機分為大腦中動脈栓塞7 d、14 d和28 d 3個亞組，每個亞組6只。

1.2 模型制備實驗動物以300mg/kg水合氯醛腹腔麻醉，仰臥位固定，參考Kuge造模法［3］，分離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA），離斷ECA的分支，在游離出的ECA剪一小口，將制備好的尼龍線插入ECA內，通過CCA分叉處經ICA插至大腦前動脈，有阻力感時停止進線，一般插入深度平均為

（18.5±0.5）mm。缺血2 h時輕輕向外抽出尼龍線使其球端回至ECA內，實現再灌注。假手術組僅分離右側CCA并離斷右ECA，不予栓塞。

1.3 電針治療術后24 h電針組予電針治療，穴位參照大鼠的常用任督脈穴位大椎、百會、水溝、氣海、關元和承漿6穴的標記方法［4］，針刺后加電，采用華佗牌電針儀（SDZ-Ⅱ型），疏密波刺激（疏波30 Hz，密波100Hz），以身體相應部位出現輕微顫動為準。持續時間為20min，每日1次至動物處死。假手術組和模型組于手術24 h后將其同電針組大鼠固定于針刺操作臺上20min，不作任何治療。分別在電針7、14、28 d后處死大鼠。

1.4 觀察內容及療效評價

1.4.1 神經功能缺損程度評分于術后7、14、28 d采用雙盲法依據神經功能缺損程度評分表mNSS評分表［5］從肌力、肌張力、意識、共濟運動、反射等方面綜合評價大鼠腦缺血再灌注后神經功能。mNSS總分為18分，評分越高表明神經功能損傷越嚴重。

1.4.2 TUNEL細胞凋亡各組實驗時間點將動物麻醉，經左心室插管快速灌注生理鹽水進行心臟灌洗，用4％多聚甲醛灌洗固定，迅速斷頭取腦，4％多聚甲醛后固定，常規脫水，石蠟包埋，切片。切片常規脫蠟入水，按照試劑盒說明書操作，DAB顯色10min，水洗，甲基綠復染，水洗，脫水，透明，封片。光鏡下觀察凋亡細胞核被染成棕黃色。凋亡細胞計數方法：選取腦皮層部位，200倍光鏡下計數5個視野陽性細胞數目，求其陽性區百分比平均值。

1.5 統計學處理應用SPSS 15.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能缺損程度評分結果見表1。假手術組大鼠沒有神經功能缺損表現，評分均為0分。模型組和電針組均出現了不同程度的神經功能缺損癥狀，且其神經功能缺損程度評分隨時間推移而逐漸降低。在缺血再灌注后7 d、14 d和28 d，電針組神經功能缺損程度評分均小于模型組（P＜0.01）。

表1 各組大鼠再灌注時間點神經缺損程度評分比較（±s）

表1 各組大鼠再灌注時間點神經缺損程度評分比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.01。

組別n 7 d 14 d 28 d假手術組6模型組6 0 0 0 10.00±0.63 8.17±0.75 6.17±0.75電針組6 7.67±0.52*5.33±0.52*4.83±0.41*

2.2 各組大鼠大腦皮層神經元凋亡TUNEL陽性細胞數比較見表2。假手術組各個時間點偶見有凋亡神經細胞出現。與假手術組比較，模型組大鼠7 d、14 d和 28 d 3個時間點神經細胞凋亡數明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠7 d、14 d和28 d 3個時間點神經細胞凋亡數明顯減少（P＜0.01）。

表2 各組大鼠再灌注時間點大腦皮層神經元凋亡陽性細胞數比較（±s）

表2 各組大鼠再灌注時間點大腦皮層神經元凋亡陽性細胞數比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別n 7 d 14 d 28 d假手術組6模型組6 1.14±0.20 1.12±0.19 1.11±0.22 7.34±0.22*6.25±0.14*2.76±0.22*電針組6 5.24±0.15△4.14±0.13△2.04±0.13△

3 討論

有研究表明，腦組織缺血早期缺血區以神經元壞死為主，而后期缺血半暗帶發生遲發性神經元死亡則以細胞凋亡為主，故有效抑制缺血后神經細胞凋亡是腦缺血治療的關鍵［6］。細胞凋亡是有核細胞在一定條件下啟動其自身內部機制，通過內源性核酸內切酶的激活而發生的細胞死亡過程，主要以細胞皺縮、胞核凝聚以及DNA鏈在核小體間被活化的核酸內切酶切斷、形成180～200 bp等倍體的DNA片段，具有主動性、選擇性、可逆性的特點［7］。本研究結果表明，大鼠腦缺血再灌注損傷后，在缺血側腦組織可檢測到較多的凋亡陽性細胞，這進一步證明細胞凋亡乃腦缺血再灌注損傷中細胞死亡的途徑之一。

從中醫學角度上看，腦缺血針灸治療中，重視督脈和任脈的應用，在患者神經功能損傷的改善方面具有重要意義［8］。任督二脈均起自胞中。任脈行于身前，為諸陰經之海，精血津液皆灌注于內，而上通于腦。督脈行身后，循脊入腦，為陽脈之海，主周身之陽氣，與任脈共同協調人體陰陽功能。因此歷代醫家常應用督脈和任脈經穴治療中風因腦脈閉阻、陰陽氣血失調所表現出的神志異常、言語肢體功能障礙等。本實驗結果表明，電針任督脈經穴在腦梗死7 d、14 d和28 d時間點可不同程度地改善其神經功能缺損并抑制缺血側皮層神經細胞的過度凋亡。筆者推測，這是否可能與任脈通過主“妊養”上調一系列神經生長因子來保護神經元，以及督脈鼓舞推動陽氣來抑制細胞凋亡有關［9］。進一步機制需要在以后的研究工作中闡明。

［1］Luo WS，Yu HB，Yang ZX，et al.Influence of Ren and Du meridian electro-acupuncture on neuralstem cellproliferation and extracellular signal-regulated kinase pathway in a rat modelof focalcerebral ischemia injury［J］.NeuralRegen Res，2010，5（6）：433-438.

［2］楊卓欣，陳鵬典，于海波，等.針刺任督脈穴位促進腦缺血后神經再生的研究近況［J］.中西醫結合學報，2012，10（1）：19-24.

［3］Kuge Y，Minematsu K，Yamagachi T，et al.Nylon monofila-ment for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Stroke，1995，26（9）：1655-1657.

［4］李忠仁.實驗針灸學［M］.北京：中國中醫藥出版社，2003：327-329.

［5］Schallert T，Kozlowski DA，Humm JL，et al.Use-dependent structural events in recovery of function［J］.Adv Neurol，1997，73（2）：229-238.

［6］Siesj BK.Pathophysiology and treatment of focal cerebral ischemia.Part I：Pathophysiology（1992）［J］.JNeurosurg，2008，108（3）：616-631.

［7］Canese R，Fortuna S，LorenziniP，etal.Transientglobalbrain ischemia in young and aged rats：differences in severity and progression，butnot localisation，of lesionsevaluated bymagnetic resonance imaging［J］.MAGMA，1998，7（1）：28-34.

［8］楊福霞，楊卓欣，于海波，等.調任通督針法治療腦梗塞恢復期患者的臨床觀察［J］.針灸臨床雜志，2011，27（4）：48-50.

［9］楊卓欣，陳鵬典，于海波，等.針刺任督脈對腦缺血MSCs移植后促轉分化為神經元作用機制的研究思路［J］.遼寧中醫雜志，2012，39（9）：1663-1666.

E ffects of Conception and Governor Vessel Electro-acupuncture on Neurological Function and Cellular Apoptosis in Cerebral Ischem ia Rats

MU Gui-ping，ZENG Yao-chi，CHEN Peng-dian，et al.Affiliated

Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong，Shenhen 518033，China

Objective：To investigate the effects of conception and governor vessel electro-acupuncture on the neurological function and cellular apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion rats.Methods：The MCAO ratswere prepared with thread embolism method.Following electro-acupuncture intervention，the neurological behavior changeswere observed withmodified neurological severe scores（mNSS），and the cellular apoptosiswas detected with terminal deoxynucleotidyl transferasemediated nick end labeling（TUNEL）method.Results：Aftermodeling establishment，the mNSS and the number of TUNEL-positive cells were apparently increased.Compared with hose in the MCAO group at the same time-points，the mNSS and the number of TUNEL-positive cells in the electro-acupuncture group were apparently decreased.Conclusion：Electro-acupuncture at conception and governor vesselsmay protect the cerebral ischemia-reperfusion injuries via inhibiting cellular apoptosis at the cerebral cortex and improving the neurological functions.

Electro-acupuncture；Conception and governor vessels；Ischemic cerebrovascular disease；Cellular apoptosis；Neurologic impairment

R245.9+7

A

1004-745X（2014）01-0048-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.022

廣東省深圳市科技計劃項目（201203149）

△通信作者

2013-09-01）

·臨床觀察·