3種常見脂多糖所致急性肺損傷大鼠模型肺損傷程度相關性研究*

申友奎 楊 勇 董禮文 王 軍 傅曉青

（浙江省杭州市中醫院，浙江 杭州 310007）

3種常見脂多糖所致急性肺損傷大鼠模型肺損傷程度相關性研究*

申友奎 楊 勇 董禮文 王 軍 傅曉青

（浙江省杭州市中醫院，浙江 杭州 310007）

目的研究3種常見脂多糖所致急性肺損傷（ALI）大鼠模型，并探討模型制作的方法和經驗。方法選擇130只健康SD大鼠，隨機分4組，尾靜脈注射組（40只）采用尾靜脈注射造模，氣管注入模型組（40只）采用氣管注入造模，二次打擊模型組（40只）采用“二次打擊”方式造模，另選10只SD大鼠為對照組。結果完成實驗后，尾靜脈注射組死亡4只，氣管注入模型組死亡10只，二次打擊模型組死亡12只，尾靜脈注射組與氣管注入模型組、二次打擊模型死亡率組比較具有明顯差異。肺組織干濕質量比3組之間無顯著性差異；病理學顯示氣管注入模型組病理損傷不均勻，以氣道上皮的水腫、壞死脫落，氣道內以中性粒細胞為主的多種炎細胞浸潤為主要特點。尾靜脈注射組及二次打擊模型組病理損傷多較均勻，以毛細血管滲透性增高，纖維蛋白滲出，肺水腫形成為主要特點。尾靜脈注射組較氣管注入模型組量化值稍高，但未見明顯統計學差異，尾靜脈注射組、氣管注入模型組與二次打擊模型組量化值比較，量化值增高明顯，具有顯著差異（P＜0.05或0.01）。結論3種方式均能成功制造急性肺損傷模型，但尾靜脈注射組死亡率低，操作簡便且病理學較為符合人類ALI病理學改變，且穩定可靠。

急性肺損傷脂多糖模型

急性肺損傷（ALI）的相關性研究已經持續了很多年，然而其死亡率仍然居高不下，建立完善的動物模型是闡明其發病機制的前提和重要保證。理想的ALI模型應可模擬人類ALI發病機制和發生、發展過程，但目前尚無一種動物模型能完全模擬人類ALI病變特征。筆者采用目前常用的3種脂多糖所致ALI大鼠模型進行比較，為下一步研究提供切實依據。

1 材料與方法

1.1 藥物脂多糖（LPS）產自Sigma公司，批號為0111：B4。

1.2 動物健康SD大鼠，SPF級，雌雄不限，體質量250～300g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.3 分組與造模將120只SD大鼠隨機分為尾靜脈注射組、氣管注入模型組、二次打擊模型組、每組40只。再選擇10只SD大鼠作為對照組。實驗前禁食12h，自由飲水。（1）尾靜脈注射組。尾靜脈注射LPS，劑量為4mg/kg，4 h后，觀察大鼠死亡率、呼吸頻率，處死大鼠，摘取肺組織，用于病理學檢查機測定含水量。（2）氣管注入模型組。應用水合氯醛30mg/kg腹腔內注射麻醉，仰臥固定于鼠板上，消毒后逐層分離暴露氣管，沿氣管切T型切口插Y型管，建立外部呼吸通道，并用注射器分別經支氣管緩慢滴注事先用生理鹽水配制的LPS（2mg/mL）溶液，待大鼠呼吸狀態穩定后，縫合傷口后放回鼠籠。8 h后，觀察大鼠死亡率、呼吸頻率，處死大鼠采取肺組織，用于病理學檢查及含水量測定。（3）二次打擊模型組。應用水合氯醛30mg/kg腹腔內注射麻醉，仰臥固定于鼠板上，在大鼠腹腔注射麻醉后鉗夾雙側股骨中段閉合骨折，2 h后腹腔注射LPS（16mg/kg）。24 h后，觀察大鼠死亡率、呼吸頻率，處死大鼠采集肺組織，用于病理學檢查及含水量測定。

1.4 肺組織含水量測定取部分左肺，濾紙吸干表面水分，置于干燥稱量紙上稱得濕質量（W），置70℃恒溫箱，烘烤至恒重后稱量干質量（D），以濕質量/干質量（W/D）比值表示肺組織含水量。

1.5 肺臟組織學觀察取剩余左肺放入10％甲醛溶液固定，常規脫水、包埋、蘇木素伊紅（HE）染色后光鏡下觀察肺組織病理改變。將肺組織學改變程度分為“無”、“輕”、“中”和“重”4級進行比較，并量化成計量單位。比較內容包括毛細血管充血、肺泡腔纖維蛋白滲出、肺泡腔及其間隔中性粒細胞滲出、氣道黏膜上皮細胞脫落、肺泡間隔增寬，見表1。

1.6 統計學處理應用SPSS17.0統計軟件。數據以（±s）表示，兩組之間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有顯著統計學意義，P＜0.01為差異有極顯著統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠死亡率、呼吸頻率比較（1）死亡率比較：尾靜脈注射組死亡4只，均在3 h后死亡，死亡率10.00％，氣管注入模型組死亡10只，1 h內死亡5只，2 h內死亡3只，6～8 h死亡2只，死亡率25.00％，二次打擊模型組死亡12只，1 h內死亡2只，4～8 h死亡2只，8～10 h死亡8只，死亡率30.00％。（2）呼吸頻率比較：見表2。

表1 肺組織學觀察程度

2.2 肺組織含水量測定見表2。

表2 各組呼吸頻率及肺組織含水量比較（±s）

表2 各組呼吸頻率及肺組織含水量比較（±s）

與對照組比較，△P＜0.05。

組別n呼吸頻率（次/min）W/D尾靜脈注射組36 108.44±9.58△4.32±0.21△氣管注入模型組30 110.53±7.10△4.33±0.20△二次打擊模型組28 104.25±4.18△4.27±0.16△對照組10 71.50±5.00△3.99±0.21

2.3 病理學觀察從病理照片（圖1）可以看出對照組肺組織結構明顯，毛細血管充血，肺組織結構完整，肺泡腔清晰，肺泡間隔無水腫，3個模型組均有大量炎性細胞浸潤，透明帶與肺泡結構破壞，毛細血管充血，上皮細胞脫落。但氣管注入模型組病理損傷不均勻，氣道上皮的水腫、壞死脫落，氣道內以中性粒細胞為主的多種炎細胞浸潤為主要特點。尾靜脈注射組及二次打擊模型組病理損傷多較均勻，以毛細血管滲透性增高、纖維蛋白滲出、肺水腫形成為主要特點。從表3可以看出尾靜脈注射組較氣管注入模型組量化值稍高，但未見明顯統計學差異，尾靜脈注射組與二次打擊模型組具有極顯著性統計學差異（P＜0.01），氣管注入模型組與二次打擊模型組比較，量化值增高明顯，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 大鼠肺組織病理學改變（HE，200倍）

表3 肺組織學改變程度量化值（±s）

表3 肺組織學改變程度量化值（±s）

組別n病理學量化值尾靜脈注射組36 11.89±1.97氣管注入模型組30 11.63±2.06二次打擊模型組28 10.61±2.00*△與尾靜脈注射組比較，*P＜0.01；與氣管注入模型組比較，△P＜0.05。

3 討論

通過實驗研究，誘導建立可靠理想的ALI模型，是對人類ALI的發病機制和診療策略的研究的重要保障。目前建立此模型的方法主要有3種［1］：（1）物理方法，主要以創傷為主；（2）化學方法，油酸、脂肪型、整肺灌洗型、白枯草型等；（3）生物方法，內毒素型、休克復合內毒素型、急性胰腺炎型、腫瘤壞死因子型等。其中內毒素致ALI模型是急性肺損傷模型中較為經典成熟的模型。尾靜脈注射、二次打擊及支氣管滴注是目前內毒素復制大鼠ALI模型的常用的給藥途徑。

本實驗重復了3種常用的給藥途徑誘導急性肺損傷的造模方式，3組實驗動物的呼吸頻率均有明顯增快，與人類ALI的臨床較為吻合。尾靜脈注射組死亡率較低，死亡發生在造模晚期，氣管注入組死亡率較高，且死亡多出現在造模早期，可能與操作復雜、藥物濃度高，且打擊較為直接有關。二次打擊死亡率較高，死亡多出現在造模晚期，可能與第一次打擊激發引起機體全身炎癥反應綜合征，此時由于大量炎性因子的釋放和機體免疫功能降低，使機體敏感性增高，在此基礎上第二次打擊造成炎癥失控引起實驗大鼠死亡有關。

病理觀察結果顯示，3組均有大量炎性細胞浸潤、透明帶與肺泡結構破壞、毛細血管充血、上皮細胞脫落；氣管注入組病理的表現病理損傷不均勻，且氣道上皮的水腫、壞死脫落，氣道內以中性粒細胞為主的多種炎細胞浸潤更為明顯，造成的原因可能與造模過程中氣管內注入的LPS分布不均相關。尾靜脈注射組及二次打擊組病理損傷多較均勻，以毛細血管滲透性增高、纖維蛋白滲出、肺水腫形成為主要特點，可能與LPS先進入血液循環，再導致全身性膿毒血癥有關的［2］。

從3種操作方式而言，尾靜脈注射組最為簡便，二次打擊組操作較復雜，支氣管注入組操作更為復雜，且對實驗者的要求比較嚴格?？傊?種實驗模型均能成功復制ALI模型，可用來研究ALI的發生、發展過程及相關的問題的研究，是良好有效的實驗動物模型，但尾靜脈注射組死亡率低、操作簡便且病理學較為符合人類ALI病理學改變。

［1］李竹英，王雪慧，劉建秋.急性肺損傷動物模型研究進展［J］.中國中醫急癥，2011，20（11）：817-1818.

［2］朱耀斌，李曉鋒，張燕搏，等.急性肺損傷動物模型［J］.中華實用診斷與治療雜志，2011，25（7）：625-628.

Correlation Study of 3 Acute Lung Injury Rats Models induced by Lipopolysaccharides

SHEN You-kui，

YANG Yong，DONG Li-wen，et al.TCMHospital of Hangzhou City，Zhejiang Province，Zhejiang，Hangzhou 310007，China

Objective:To study 3 widely used rats models of acute lung injury by lipopolysaccharides and to discuss the modelmaking methods and experiences.Methods:130 healthy SD rats were divided into 4 groups random ly including the tail vein injection group with 40 rats，the trachea injection group with 40 rats，the secondary blow mold group with 40 rats and the control group with 10 rats.Results:After being finished the experiment.There were some rats died such as 4 rats in the tail vein injection group，10 rats in the trachea injection group，12 rats in the secondary blow mold group.Compared with the trachea injection group and the secondary blow mold，the tail vein injection group had significant differences in themortality.There were no significant differences among 3 groups in wet and dry lung tissuemass ratio.3 groups of pathology showed that the trachea injection group pathological damage was uneven.Meanwhile，the airway epithelial edema and the necrosis felloff. The airway predominantly neutrophils were a variety of inflammatory cell infiltration as the main characteristics. The tail vein injection group and the secondary blowmold group pathological damage weremore uniform，capillary permeability increase，fibrin exudation and edema formation as the main characteristics.quantitative value of pathological in tail vein injection group was a bit higher than that in the trachea injection group.However，there were no significant differences among these indicators.The tail vein injection group and the trachea injection group compared with the secondary blow mold group quantitative values of pathological increased obviously，there was the extremely significant difference in them.Conclusion:3 methods can successfully manufacture model of acute lung injury.Themortality rate is low，easy to operate and pathologicalmore accord with human ALI pathological change in the tail vein injection group.Themodel is stable and reliable.It is the further study basis of acute lung injury occurrence，development process and related problems.

Acute lung injury；Lipopolysaccharide；Model

浙江省自然科學基金資助項目（Y2111294）

R285.5

A

1004-745X（2014）01-0019-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.009

2013-09-12）

·病例報告·