16S rDNA測序在兒童血流感染細菌性病原菌分布中的應用

黃君華，張書婉

（1.西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710021；2.西安市兒童醫院檢驗科，陜西 西安 710003）

16S rDNA測序在兒童血流感染細菌性病原菌分布中的應用

黃君華1，張書婉2

（1.西安醫學院醫學技術系，陜西 西安 710021；2.西安市兒童醫院檢驗科，陜西 西安 710003）

目的 探討PCR方法在分析血流感染病原菌分布中的作用，為兒童細菌性血流感染的流行病學調查提供新的思路。方法從兒科重癥監護病房（PICU）收集100份疑似血流感染患兒的外周靜脈血進行血培養，同時擴增并測序細菌16S rDNA，比較培養結果與PCR結果。結果100份血液標本中11份細菌培養陽性，陽性率為11%；PCR法23份陽性，陽性率為23%，二者比較差異具有統計學意義(χ2=10.08，P＜0.05)；在23例PCR陽性標本中，革蘭氏陽性球菌占65.2%，其中表皮葡萄球菌最多(6例，26.1%)，革蘭氏陰性菌占34.8%，以大腸埃希菌為主(4例，17.4%)。結論16S rDNA-PCR結合測序的方法可以很好地鑒定血流感染病原菌，與血培養相比能更客觀地反映病原菌分布，可作為一種新的流行病學方法在臨床應用；兒科重癥監護病房血流感染病原菌以革蘭氏陽性球菌為主，尤以表皮葡萄球菌最常見。

血流感染；16S核糖體核糖核酸；細菌；測序；兒童

血流感染(Bloodstream Infection，BSI)是一種嚴重的全身感染性疾病，病原微生物在循環血液中呈一過性、間歇性或持續性存在，并引起機體損害和臨床癥狀[1]。近30年來，隨著免疫制劑的廣泛使用及侵入性治療的廣泛開展，兒童血流感染的發病率正在日益上升，病死率也很高[2]。目前，血流感染的診斷及病原菌分布的流行病學資料來源主要依靠血培養(Blood Cultivation,BC)，然而由于血培養耗時長，陽性率低，使所得到的統計學資料與客觀現實有一定的差距。本研究旨在通過對疑似血流感染標本同時進行培養和16S rDNA通用引物PCR，比較二者的陽性率及病原菌分布上的差異，為兒童細菌性血流感染的流行病學調查提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年10月至2013年5月在西安市兒童醫院PICU住院的疑似血流感染患兒(發熱＞38℃或低體溫＜36℃，可伴有寒戰等全身中毒癥狀或中性粒細胞增多伴核左移等)血標本100份；嚴格按照無菌操作流程采集患兒外周靜脈血6 ml，其中2 ml注入BD公司EDTA-K2抗凝管，4 ml注入兩瓶兒童專用血培養瓶（2 ml/瓶）。

1.2 方法

1.2.1 細菌總DNA的提取 將2 ml血液標本離心5 min，取沉淀，應用QIAamp Blood DNA Mini Kit試劑盒（QIAGEN，Cat.No.51106），操作步驟按照試劑盒說明書。

1.2.2 PCR擴增 引物序列參照Campbel等[3]和Xu等[4]設計，PSL(f)：AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA，XB4(r)：GTGTGTACAAGGCCCGGGAAC-3，擴增產物大小為615 bp。25μl PCR反應體系，包括：10×buffer 2.5μl，10 mmol/L dNTP 0.25μl，25 mmol/L MgCl22.5μl，3.3μmol/L PSL、XB4各0.5μl，Taq酶(5 U/μl)0.125μl，DNA模板1μl，ddH2O 17.625μl。PCR反應程序：預變性96℃10 min；96℃變性1 min，退火溫度55℃1 min，延伸72℃1 min，共30個循環；最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳的電壓為6 V/cm，采用溴化乙錠(EB)染色20 min，后在凝膠成像分析系統拍照保存。

1.2.3 細菌培養 將兒童專用血培養瓶放入全自動血培養儀BACK-ALERT 3D進行培養，對陽性瓶細菌經VITEK鑒定到種。

1.2.4 測序比對 擴增產物經純化后送上海生工生物工程有限公司測序，登陸http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/Blast.cgi，將測序結果在GenBank中進行BLAST比對。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，采用配對四格表資料的χ2檢驗對培養和PCR方法的陽性率進行比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 16S rDNA通用引物擴增臨床標本 16S rDNA通用引物的擴增產物與預期片段大小(615 bp)相符合(見圖1)。

圖1 16S rDNA通用引物擴增臨床標本

2.2 兩種不同方法檢測結果 100份血液標本中11份細菌培養陽性，陽性率為11%；PCR法23份陽性，陽性率為23%，二者差異具有統計學意義(χ2= 10.08，P＜0.05)，見表1。

表1 血流感染16S rDNA-PCR與血培養敏感度比較（份）

2.3 PCR與血培養檢出病原菌分布 在23例PCR陽性標本中革蘭氏陽性球菌占65.2%，其中表皮葡萄球菌最多(6例，26.1%)，革蘭氏陰性菌占34.8%，以大腸埃希菌為主(4例，17.4%)，見表2。

表2 16S rDNA-PCR與血培養檢測血流感染病原菌分布[株(%)]

3 討 論

血流感染時細菌侵入血液循環并大量繁殖，是一種嚴重的細菌感染性疾病。傳統血培養不僅是目前診斷血流感染的金標準，而且也是一個重要的流行病學工具，血培養得到的統計學資料（病原菌分布及藥敏資料）常作為臨床醫生經驗性治療的依據。然而，血培養本身存在的局限性導致其所得到的血流感染病原菌分布資料與客觀情況有較大的差異。

兒童血流感染以ICU的檢出率最高[5]，因此本研究選取PICU患兒作為研究對象，共收集100份血液標本，用細菌16S rDNA通用引物擴增測序，所用引物PSL/XB4具有很高的檢測靈敏度，能夠達到1.5× 102CFU/ml[6]。100份標本中血培養陽性11例，而PCR方法陽性23例，PCR陽性率(23%)是血培養陽性率(11%)的2.09倍，二者差異有統計學意義，顯示PCR方法檢測陽性率高于培養方法。

本組資料結果顯示，對于PICU患兒，PCR方法檢測的病原菌數量和種類多于血培養，以表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和溶血葡萄球菌為主，而血培養方法所檢測的病原菌主要是表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和大腸埃希菌。由結果可知，PCR方法所得到的病原菌分布與培養結果略有差異，如果增加樣本量并避免假陽性，則PCR方法所得到的統計學結果能更加客觀全面地反映血流感染細菌性病原菌分布。

引起血流感染的病原菌種類廣泛。近20年來，凝固酶陰性葡萄球菌等革蘭氏陽性菌和大腸埃希菌引起的血流感染發病率增加[7]。本研究顯示，2012年10月至2013年5月在西安市兒童醫院PICU血流感染以革蘭氏陽性球菌最多(占65.2%)，這與徐月波等[5]的報道一致，而Abou Elella等[8]的研究認為兒童心臟ICU血流感染主要病原菌為革蘭氏陰性菌。本組資料顯示表皮葡萄球菌(占26.1%)是PICU血流感染的首位病原菌，這與徐月波及Luthander等[5，9]的報道有一定的差異，而與Lv等[10]的研究一致。在本研究中革蘭氏陰性菌占34.8%，以大腸埃希菌為主(占17.4%)，與Al-Hasan[11]的報道一致，其他為非發酵菌(占17.4%)；革蘭氏陽性菌以葡萄球菌屬為主(占52.2%)，其中凝固酶陰性葡萄球菌占39.1%。上述資料說明不同檢測方法、不同年代、不同地域、不同科室、不同年齡段兒童血流感染的病原菌分布有一定的差異。

綜上所述，為了獲得更加客觀真實的血流感染細菌性病原菌分布，本研究直接從全血標本中提取細菌基因組DNA，并應用通用引物PCR擴增細菌16S rRNA基因部分片段，通過測序來鑒定病原菌種類，從而用分子生物學方法得到血流感染細菌菌譜，為得到更加準確完善的統計學資料提供了一種新的思路和方法。此外，細菌性病原菌因時間、地區、科室的不同而有不同的分布，每個地區或醫院應該建立自己的血流感染病原菌分布數據庫，這可以更好地指導本院合理地診斷血流感染和選擇抗生素。

[1] See LL.Bloodstream infection in children[J].Pediatr Crit Care Med,2005,6(3 Suppl):S42-44.

[2]Couto R,Pedrosa T,Tofani.Risk factor for nosocomial infection in a neonatal intective care unit[J].Infect Control Hosp Epidemiol, 2006,27(5):571-575.

[3]Campbell P,Phillips J,Heidecker G.Detection of Pseudomonas (Burkholderia)cepacia using PCR[J].Pediatric pulmonology, 2005,20(1):44-49.

[4]Xu J,Moore JE,Millar BC,et al.Employment of broad range 16S rDNA PCR and sequencing in the detection of aetiological agents of meningitis[J].New Microbiol,2005,28(2):135-143.

[5]徐月波,董 琳,劉 琳,等.兒童醫院獲得性血流感染的臨床特征和病原學分析[J].中華傳染病雜志,2013,31(4):221-226.

[6]張 寧,孟 欣,惠凌云,等.細菌性感染PCR診斷方法的建立及其應用研究[J].中華醫院感染學雜志,2011,21(14):3079-3081.

[7]魏澤慶,沈 萍,陳云波,等.Mohnarin2011年度報告：血流感染細菌構成及耐藥性[J].中華醫院感染學雜志,2012,22(24): 5497-5502.

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[9]Luthander J,Bennet R,Giske CG,et al.Age and risk factors influence the microbial aetiology of bloodstream infection in children [J].Acta Paediatr,2013,102(2):182-186.

[10]Lv H,Ning B.Pathogenesis of bloodstream infection in children with blood cancer[J].Exp Ther Med,2013,5(1):201-204.

[11]Al-Hasan MN,Huskins WC,Lahr BD,et al.Epidemiology and outcome of Gram-negative bloodstream infection in children:a population-based study[J].Epidemiol Infect,2011,139(5):791-796.

Analysis of etiology of bloodstream infection in children by sequencing the 16S rDNA.

HUANG Jun-hua1,ZHANG Shu-wan2.1.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi,CHINA;2. Clinical Laboratory,Xi'an Children's Hospital,Xi'an 710003,Shaanxi,CHINA.

Objective To explore the value of PCR for analyzing the pathogenic spectrum of bloodstream infection(BSI)in children,and to provide a new thought for epidemiological survey of BSI.MethodsA total of 100 patients in PICU with suspected bacterial infections were included,and then performed blood cultivation(BC)and analyzed by 16S rDNA-PCR following by sequencing and BLAST.At the same time,the results of two methods were compared.ResultsAmong the 100 specimens,the positive rate of BC and PCR are 11%and 23%,respectively. There was significant difference between the two methods(χ2=10.08,P＜0.05).Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria accounted for 65.2%and 34.8%,respectively,in 23 bacteria.The predominant pathogens were Staphylococcus epidermidis(26.1%),followed by Escherichia coil(17.4%).Conclusions Compared with BC,16S rDNA-PCR and sequencing which provide a new way of analyzing the pathogenic spectrum of BSI might be effective for epidemiological investigation.The pathogens of BSI are mainly gram-positive bacteria in PICU,and Staphylococcus epidermidis is the most common one.

Bloodstream Infection;16S rDNA;Bacteria;Sequencing;Child

R725.5

A

1003—6350（2014）10—1467—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.10.0564

2013-12-04)

黃君華。E-mail：huangjunhua1985@163.com