一株可降解孔雀石綠的肺炎克雷伯氏菌的分離與鑒定

李媛++張立強

摘要：孔雀石綠是一種具有致癌致畸作用的環境污染物。從武昌理工學院污水處理廠的活性污泥中分離得到一株可降解孔雀石綠的細菌，命名為MG-1。生理生化試驗分析初步鑒定該菌為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），進一步的序列分析顯示該菌16S rDNA與肺炎克雷伯氏菌MBR11菌株的16S rDNA一致性達99%，進一步證明該菌為肺炎克雷伯氏菌。試驗證實肺炎克雷伯氏菌具有降解孔雀石綠的特性，其降解機理還有待于做進一步研究。

關鍵詞：孔雀石綠；肺炎克雷伯氏菌；16S rDNA

中圖分類號：S949 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）02-0298-03

Isolation and Characterization of a Malachite Green-degrader Klebsiella pneumoniae

LI Yuan1，ZHANG Li-qiang2

（1.Wuhan Environmental Monitoring Center，Wuhan 430015， China；2.Institute of Fishery Research of Wuhan City，Wuhan 430207，China）

Abstract： Malachite Green is a type of environmental pollutant inducing cancer and abnormality. A bacterium with the capability of degrading malachite green was isolated from the sludge sample collected from wastewater system of Wuchang university of Technology and designated as strain MG-1. According to the physiological-biochemical characteristics， it was preliminarily identified as Klebsiella pneumoniae. The 16S rDNA sequence analysis revealed that it has 99% homology with Klebsiella pneumoniae strain MBR11. All the data indicated that it was a Klebsiella pneumoniae stain. A further study is needed to explore the degradation mechanism.

Key words： Malachite Green； Klebsiella pneumoniae； 16S rDNA

孔雀石綠（C23H25ClN2，Malachite Green，MG）是一種合成的三苯甲烷類工業染料，被廣泛用于制陶業、紡織業、皮革業、食品顏色劑和細胞化學染色劑等領域[1]，也可用來治療各類水生動物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等[2-4]。但是研究表明，孔雀石綠及其代謝產物無色孔雀石綠在魚體內和環境中殘留時間長，它們分子中含有的化學官能團——三苯甲烷被確證具有高毒、高殘留、“三致”等毒副作用[5，6]。在2002年5月農業部發布的《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》上，孔雀石綠屬于禁用藥物。由于中國的水產養殖曾經長期使用孔雀石綠，導致水環境的嚴重污染，因此借助有效的工具消除環境中積累的孔雀石綠就顯得十分必要。以微生物降解為基礎的生物修復技術是消除環境中孔雀石綠污染的有效方法。 目前已報道的孔雀石綠降解菌主要有細菌中的假單胞菌（Pseudomonas sp.）、芽孢桿菌（Bacillus sp.）、節桿菌（Arthrobacter sp.）等[7-12]，但鮮見克雷伯氏菌屬（Klebsiella）的細菌降解孔雀石綠的報道。本研究從武昌理工學院污水處理廠的活性污泥中分離到1株能降解孔雀石綠的細菌，通過16S rDNA序列鑒定為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）。該菌株的獲得豐富了孔雀石綠降解菌株的多樣性，并為孔雀石綠污染廢水的處理提供了菌株資源。

1 材料與方法

1.1 培養基與試劑

1.2 菌株篩選

1.3 菌株生化鑒定

菌株培養于LB培養基平板上，30 ℃培養24 h，取固體斜面的新鮮培養物，經革蘭氏染色后，用光學顯微鏡觀察菌落形態； 其他各項生理生化試驗參照文獻[14]進行； 根據細菌的形態特征及生理生化反應參照文獻[15]鑒定至種。

1.4 菌株分子學鑒定

2 結果與分析

2.1 菌株分離與生化鑒定結果

2.2 菌株16S rDNA基因序列分析

以菌株的基因組DNA為模板，利用細菌16S rRNA基因通用引物16S rDNA-F、16S rDNA-R進行PCR擴增，得到長度為1 532 bp的擴增產物（圖1）。將此序列用Blast進行比對，結果顯示該序列與肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）編號為MBR11的菌株的16S rDNA一致性（Identities）達99% （圖2）。目前細菌分類學家普遍認為當某2個細菌的16S rRNA一致性大于95%時，可將其歸為同一屬[14]。根據上述相似性比較結果，再結合生理生化特性將該菌株鑒定為克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）

3 討論

孔雀石綠作為一種染料及漁用殺菌劑曾在中國廣泛使用，然而大量研究表明孔雀石綠及其代謝產物具有致癌致畸作用，目前中國已經將其列為漁類養殖禁用藥物，但是已經在環境中積累及違法使用的孔雀石綠污染物依然存在，并且將長期危害環境。微生物降解孔雀石綠是一種既經濟又實用的生物學手段。本研究分離到一株降解菌MG-1，經過生理生化分析并結合16S rDNA基因序列相似性分析將其初步鑒定為Klebsiella sp.，其降解機理有待進一步研究。

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