無花果果醋發酵工藝優化

繆 靜 殷曰彩 馮志彬 程仕偉

MAO Jing YIN Yue－cai FENG Zhi－binCHENG Shi－wei

（魯東大學生命科學學院，山東 煙臺 264025）

（College of Life Science，Ludong University，Yantai，Sandong 264025，China）

無花果果實皮薄無核，肉質松軟，風味甘甜，營養豐富，含有人體所需的18種氨基酸，尤以抗疲勞的天門冬氨酸（1.9%干重）含量最高，另外，維生素 A、E、C及硒、鋅、鈣等礦物質含量也極其豐富［1］。無花果具有較高的藥用價值，中醫學［2］認為，具有滋養、健脾、開胃、清熱、潤腸、解毒、消腫、降血壓等功效；無花果還含有大量的膳食纖維、果膠等成分，可驅除人體內的鉛，降低膽固醇和血糖，對心、腦血管硬化及糖尿病具有治療作用，還可降低肝臟中的酯質含量，對脂肪肝有一定的療效［2－4］。本研究采用成熟無花果為材料，此時果實含糖量及枸櫞酸等有機酸含量最高，有利于微生物的生長及提高出醋率。

無花果果醋的研究論文、專利及產品雖然有見出現，但是數量很少，且工藝條件的優化也僅僅做了單因素及正交試驗［5］。Design Expert軟件在質量控制、管理和科研領域應用較多，但在果醋培養條件優化方面的研究未見報道。本研究擬利用Design Expert軟件，在單因素試驗的基礎上，通過響應面法對無花果醋的發酵條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

活性干酵母：湖北安琪生物集團；

醋酸菌：魯東大學生命科學學院保藏。

1.1.2 原料和試劑

無花果：煙臺產；

蔗糖：食品級，市購；

果膠酶：2萬U／g，諾維信酶制劑公司；

酵母粉、蛋白胨、瓊脂：生化試劑，北京奧博星生物技術有限公司；

水楊酸、酒石酸鉀鈉、NaOH：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要設備

旋轉式搖床：HZQ－Q型，哈爾濱東聯電子技術公司；

紫外—可見分光光度計：Agilent 8453型，安捷倫科技公司上海分公司；

生化培養箱：LRH－280型，廣東省醫療器械廠；

高壓滅菌鍋：LS－C50L型，江陰濱江醫療設備廠；

發酵罐：5BGZ－2002型，上海保興生物工程設備公司；

手持糖度計：VBR90A型，杭州匯爾儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 酵母菌活化 用2%（m／V）的葡萄糖加入1%（m／V）安琪活性干酵母，敞開，30℃下連續攪拌，活化約30 min，直至糖水中出現大量微小氣泡［6］。

1.2.3 酒精發酵 將無花果鮮果破碎榨汁后，調整果汁中還原糖含量至17%（m／V）左右，接入活化的酵母菌，于26℃發酵。酒精發酵過程中測定酒精度，當酒精度達到7%（V／V）左右時，終止酒精發酵轉入醋酸發酵［7，8］。

1.2.4 醋酸發酵 將100 m L無花果酒液裝入500 m L三角瓶，接入醋酸菌，置于旋轉搖床在一定溫度和轉速下發酵，每隔12 h測酸度一次，至酸度不再上升時結束發酵［9，10］。

1.2.5 單因素試驗 選取轉速、溫度、接種量、發酵時間4個因素做單因素試驗，并選取對無花果醋發酵影響較大的因素做下一步的優化試驗。在溫度為32℃，接種量5%，發酵5 d的條件下，設置搖床轉速分別為160，180，200，220，240 r／min進行醋酸發酵確定最適轉速；在轉速為200 r／min，接種量5%，發酵5 d的條件下，分別于28，30，32，34，36℃進行醋酸發酵確定最佳發酵溫度；在溫度為32℃，轉速200 r／min，發酵5 d的條件下，采用3%，5%，7%，9%，11%的接種量進行果醋發酵選擇最有利于果醋發酵的接種量；在溫度為32℃，接種量5%，轉速200 r／min的條件下，分別在果醋發酵的第3、5、7及9天取樣測定醋酸濃度確定果醋最佳發酵周期。過程中以醋酸濃度和轉化率作為評價指標。

1.2.6 優化試驗 采用Box－Behnken設計進行試驗設計，采用Design Expert 8.0軟件進行數據處理和回歸分析，對無花果醋發酵工藝進行優化［11，12］。

1.2.7 測定方法

（1）總酸：采用NaOH滴定法；

（2）揮發酸：采用蒸餾法；

（3）酒精度：采用重鉻酸鉀比色法；

（4）糖度：用糖度計測定；

（5）還原糖（以葡萄糖計）：采用水楊酸試劑比色法［10］。

（6）醋酸轉化率：按式（1）計算。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗優化無花果醋發酵工藝

2.1.1 轉速對無花果醋發酵的影響 氧氣為醋酸菌生長繁殖及醋化乙醇所必需，培養系統的溶氧量將直接影響醋酸的發酵，在搖瓶裝液量一定的情況下系統溶氧主要受搖床轉速的影響［10］，隨著轉速的增加溶氧會隨之增加。由圖1可知，搖床轉速為200 r／min時醋酸產量及轉化率最高，過高或過低的轉速均不利于醋酸發酵。這主要是因為醋酸菌生長及醋酸的合成均需要大量氧氣的參與，過低的溶氧抑制了醋酸菌的生長并影響反應的正常進行，過高的轉速雖然會增加發酵液中氧氣含量，但也會導致底物乙醇的揮發耗損，同時伴隨產生過高的剪切力也不利用醋酸菌的生長。

圖1 轉速對無花果醋發酵的影響Figure 1 Effects of rotate speed on fig vinegar fermentation

2.1.2 溫度對無花果醋發酵的影響 溫度影響菌體代謝合成速率及酶的活性［6］。由圖2可知，在28～32℃時，醋酸菌代謝速度加快，醋酸產量隨溫度上升而增加，在32℃時達到最大產量，之后逐漸降低，在36℃時產量最低，可能是高溫不利于醋酸菌的生長，并造成菌體內部分酶失活，影響醋酸的合成。

圖2 溫度對無花果醋發酵的影響Figure 2 Effects of temperature on fig vinegar ermentation

2.1.3 接種量對無花果醋發酵的影響 由圖3可知，在試驗范圍內接種量對無花果醋發酵的影響不大，除3%接種量產量略低外，其它試驗組醋酸產量均在40 g／L以上，其中以5%（m／V）接種量醋酸產量最高。分析發酵液中的酒精含量，3%（m／V）接種量酒精殘留量較高，適當延長發酵周期亦能獲得較高的產量，這也說明接種量對發酵周期有一定的影響，較小的接種量會延長醋酸的發酵周期。

2.1.4 發酵時間對無花果醋發酵的影響 由圖4可知，發酵3 d時酒精醋化過程尚未完成，醋酸產量僅約為完全醋化時的60%左右，5～7 d時醋酸產量波動不大，發酵基本結束，繼續延長發酵時間醋酸含量沒有明顯增加，故無花果醋的發酵時間應以5～7 d為宜。

圖3 接種量對無花果醋發酵的影響Figure 3 Effects of inoculation volume on fig vinegar fermentation

圖4 發酵時間對無花果醋發酵的影響Figure 4 Effects of time on fig vinegar fermentation

2.2 響應面法優化無花果醋發酵工藝

2.2.1 響應面分析方案及試驗結果 根據單因素試驗結果，選擇可能形成曲面且對產量影響較大的3個因素（轉速、溫度、接種量），根據Box－Behnken試驗原理以無花果醋中醋酸含量為響應值進行優化，試驗因素水平編碼值見表1，試驗方案及結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Variables and levels in the three－variable／threelevel response surface design

利用Design Expert軟件對表2中的試驗數據進行多元回歸擬合，得到的回歸方程：

表2 響應面試驗結果及分析Table 2 Arrangment and results of the three－variable／three－levels central composite design

表3 回歸模型各項的方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

表3的方差分析顯著性檢驗表明，該模型回歸顯著，并且該模型的決定系數R2＝0.985，響應值的變化有98.5%來源于所選因素，僅有1.5%的綜合指標總變異不能由該模型解釋，說明該模型與實際試驗擬合較好，自變量和響應值之間線性關系顯著。失擬項P＝0.086 5＞0.05，表明方程模型失擬不顯著，說明回歸方程能很好的描述發酵參數與醋酸含量的關系。各變量P＜0.05時說明其對模型作用顯著，由P值大小可知，在所選各因素的水平范圍內對醋酸產量影響均極其顯著。

圖5 轉速和溫度交互影響醋酸產量的曲面圖及等高線圖Figure 5 Response surface plot and its corresponding contour plot showing the effects of rotate speed and temperature on vinegar production

圖6 轉速和接種量交互影響醋酸產量的曲面圖及等高線圖Figure 6 Response surface plot and its corresponding contour plot showing the effects of rotate speed and inoculation volume on vinegar production

2.2.2 響應面分析及優化 通過上述二次多項回歸方程所作的響應曲面圖及其等高線圖見圖5～7。通過該組動態圖即可對任何兩因素的交互影響醋酸產量進行評價分析，從中確定最佳因素水平范圍。由圖5～7可知，轉速和溫度對醋酸產量影響顯著，表現為曲線較陡，隨著二者的增減，醋酸產量變化較大，接種量對醋酸產量影響較小，曲線表現較為平緩。通過軟件綜合分析，得出醋酸濃度的最大估計值為52.07 g／L，與之對應的自變量實際值為轉速220 r／min，溫度33℃，接種量5.39%。

圖7 溫度和接種量交互影響醋酸產量的曲面圖及等高線圖Figure 7 Response surface plot and its corresponding contour plot showing the effects of temperature and inoculation volume on vinegar production

2.2.3 驗證實驗 以2.2.2確定的最佳條件進行3次重復驗證實驗，無花果醋酸平均含量達到52 g／L，與目前成品果醋的酸度（50～60 g／L）相當［13］，與理論預測值基本吻合，可見該模型能較好的預測無花果醋的發酵情況。

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上用響應面分析法對無花果醋發酵工藝進行優化。得到最佳發酵條件為轉速220 r／min、溫度33℃、接種量5.39%，在此條件下，醋酸含量可達52 g／L。經方差分析得知轉速和溫度對無花果醋的發酵影響是顯著的，接種量影響較不明顯。另外，驗證值同回歸方程所得到的最大預測值非常接近，說明回歸方程能較真實的反應篩選因素的影響，建立的模型與實際情況吻合度較高，因此用響應面法優化無花果醋的培養條件是有效可行的。下一步可以在發酵罐中進行優化，從而為無花果醋的產業化生產打下基礎。

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