超聲波輔助提取酵母源類金屬硫蛋白工藝的優化

李 冰 王 穎，2 徐炳政 張東杰

LI Bing 1 WANG Ying 1，2 XU Bing－zheng 1 ZHANG Dong－jie 1

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China；2.National Coarse Cereals Engineering Research Center，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

金屬硫蛋白是一類低分子量（2～7 k D）、富含半胱氨酸（20%～30%）的金屬結合蛋白，廣泛存在于動物、植物以及微生物體內，具有清除自由基、抗電離輻射、降低重金屬中毒、參與體內微量元素代謝、延緩衰老等生物學功能［1，2］，被逐漸應用到醫藥、化妝品、保健品和環境監測［3］等領域中。

金屬硫蛋白的特殊功能已引起國內外學者們［4－7］的廣泛關注，并有學者分別對馬腎、兔肝、鼠肝、鯉魚等動物的主要組織進行誘導提取分離得到金屬硫蛋白。研究表明［8］，一些金屬離子可誘導微生物產生應激反應，從而使菌體合成并積累類金屬硫蛋白。與動物源提取相比，通過微生物源誘導產生金屬硫蛋白具有來源廣、成本低、發酵周期短等優點［9］。金屬硫蛋白是一類具有活性的小分子蛋白，當其原有的穩定環境發生改變，很容易發生聚合而降低甚至失去其原有的生物活性。所以，在研究誘導酵母菌生產類金屬硫蛋白的過程中，選擇適宜的提取方法和適宜的提取條件是非常重要的。Ovadia等［10］從吐根中提取生物堿，用超聲波提取30 min比用索氏提取5 h的堿量還多。Liu Yuanfa等［11］利用超聲波輔助提取蜂膠黃酮類功能性物質的研究時發現，超聲波提取所采用的時間與傳統方法相比縮短了30 h以上，黃酮得率也較傳統方法要高。同樣作為胞內產物的酵母源金屬硫蛋白，本研究擬采用超聲波輔助提取，以期利用超聲波產生的空化、振動、粉碎、攪拌等綜合效應得到快速、高得率的金屬硫蛋白提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 材料

釀酒酵母N－8：本課題組誘導分離自存菌株；

Tris：美國Sigma公司；

酵母菌金屬硫蛋白（MT）酶聯免疫分析試劑盒：上海勁馬生物科技有限公司；

其它試劑：均為分析純。

1.1.2 儀器

冷凍干燥機：ALPHA1－2 LD plus型，德國Christ公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK－S24型，上海森信實驗儀器有限公司；

超聲波處理器：FS－450N型，上海生析超聲儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：T6新世紀型，北京普析通用儀器有限公司；

臺式離心機：LD4－40型，北京京立離心機有限公司。

1.2 分析測定

1.2.1 金屬硫蛋白的測定 采用酶聯免疫分析（ELISA）法［12］。

1.2.2 巰基活性的測定 采用簡化的巰基試劑（DTNB）法［12］。

1.3 金屬硫蛋白的誘導合成

將保存菌種置于YPD活化培養基中（蛋白胨20 g／L，葡萄糖20 g／L，酵母膏10 g／L），30℃搖床培養24 h。再將活化液2 m L接種至100 m L YEPD誘導培養基中（蛋白胨20 g／L，葡萄糖20 g／L，酵母膏10 g／L，CuCl20.7 mmol／L），30℃搖床誘導培養62 h。以3 000 r／min的速度離心15 min收集菌體。

1.4 單因素試驗設計

1.4.1 料液比對提取工藝的影響 將菌體與0.05 mol／L p H 8.6的Tris—HCl緩沖液分別以1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（m∶V）比例混勻，在300 W下超聲處理30 min，充分混勻后，3 000 r／min離心25 min。上清液于80℃下恒溫處理8 min，迅速冷卻，3 000 r／min離心25 min，取上清液，凍干備用。以巰基活性為指標，以金屬硫蛋白含量做參考。

1.4.2 超聲波輔助提取時間對提取工藝的影響 將菌體與0.05 mol／L p H 8.6的Tris－HCl緩沖液以1∶15（m∶V）比例混勻，在300 W 超聲強度下分別提取10，20，30，40，50 min，充分混勻后3 000 r／min離心25 min。上清液于80℃下恒溫處理8 min，冷卻后混勻，3 000 r／min離心25 min，取上清液，凍干備用。以巰基活性為指標，以金屬硫蛋白含量做參考。

1.4.3 超聲波提取強度對提取工藝的影響 將菌體與0.05 mol／L p H 8.6的 Tris—HCl緩沖液以1∶15（m∶V）比例混勻，分別在100，200，300，400，500 W 超聲強度下提取30 min，充分混勻后3 000 r／min離心25 min。上清液于80℃下恒溫處理8 min，冷卻后混勻，3 000 r／min離心25 min，取上清液，凍干備用。以巰基活性為指標，以金屬硫蛋白含量做參考。

1.4.4 熱變性時間對提取工藝的影響 將菌體與0.05 mol／L p H 8.6的 Tris—HCl緩沖液分別以1∶15（m∶V）比例混勻，在300 W超聲強度下提取30 min，充分混勻后3 000 r／min離心25 min。上清液分別于80℃下恒溫進行4，6，8，10，12 min的熱處理，冷卻后混勻，3 000 r／min離心25 min，取上清液，凍干備用。以巰基活性為指標，以金屬硫蛋白含量做參考。

1.5 Box－Behnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，根據Box－Behnken試驗設計原理［13］，以粗提液巰基活性為指標，設計3因素3水平響應面分析試驗，應用SAS 9.1統計軟件對結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 料液比的選擇 由圖1可知，隨著提取液的增加，粗提液的巰基活性和金屬硫蛋白含量明顯提高。這時大量的提取液使酵母菌細胞分散更均勻，破壁率提高。但當料液比達到1∶15（m∶V）時，隨著提取液的增多，粗提液的巰基活性和金屬硫蛋白含量增大不顯著。為了降低成本和減少后續濃縮工作量，綜合考慮，選取最適超聲提取料液比為1∶15（m∶V）。

圖1 料液比對超聲提取率的影響Figure 1 Effect of the ratio of material to extractant on ultrasonic extraction rate

2.1.2 超聲提取時間的選擇 由圖2可知，隨著超聲提取時間的增加，提取液的巰基活性和金屬硫蛋白含量呈現先增大后減小的趨勢，在30 min時達到最大。短時間的提取，酵母細胞破壁不完全，長時間提取，容易導致巰基被破壞。故選取最適提取時間為30 min。

圖2 提取時間對超聲提取率的影響Figure 2 Effect of the the extraction rate on ultrasonic extraction time

2.1.3 超聲提取強度的選擇 由圖3可知，隨著提取功率的增大，粗提取液的巰基活性和金屬硫蛋白含量也隨之增大，到300 W時達到最大。之后隨著提取強度的增大，粗提液中的巰基活性和金屬硫蛋白含量平緩下降。綜合考慮，選擇300 W為最適提取強度。

圖3 提取強度對超聲提取率的影響Figure 3 Effect of the extraction rate on ultrasonic power

2.1.4 熱處理時間的選擇 金屬硫蛋白由于其特殊的堅固構象而具有一定的熱穩定性，短時間的熱處理不會影響金屬硫蛋白的活性。80℃加熱處理是為了在最低限度破壞金屬硫蛋白的條件下使其它雜蛋白變性失活，為測定和下一步純化提供方便。

由圖4可知，加熱少于8 min對粗提液的巰基活性和金屬硫蛋白含量影響都很小，超過8 min后，巰基活性和金屬硫蛋白含量呈快速下降趨勢。因為長時間的高溫加熱會導致巰基不穩定。所以80℃最適熱處理時間為8 min。

圖4 熱處理時間對提取率的影響Figure 4 Effect of the extraction rate on the time of thermal denaturation

2.2 中心組合設計結果與分析

2.2.1 Box－Behnken試驗設計 根據單因素試驗，得到超聲波輔助金屬硫蛋白的提取最佳因素條件為料液比1∶15（m∶V），提取時間30 min，超聲波功率300 W，水浴熱處理時間8 min。根據此條件設計試驗因素及水平見表1。

表1 試驗設計因素水平表Table 1 Code of factors and levels

2.2.2 回歸模型的建立 根據中心組合試驗數據（表2），以料液比、提取時間、提取強度為自變量，以粗提液的巰基活性為因變量建立二次多元回歸方程：

由表3可知，此模型是極顯著的（P＜0.01），失擬項P＝0.146 185＞0.05，不顯著，模型的R2＝99.18%，說明該模型響應值的變化99.18%都來自所選的因素。可見，模型與試驗值擬合較好，該模型可用于粗提液巰基活性的理論預測。

表2 中心組合試驗設計及響應值Table 2 Experimental design and results of central composition design

2.2.3 響應面分析 為了更好地研究自變量因素變化與響應值之間的規律，將自變量中的3個因素固定其中的一個變量，取為0水平，進行降維分析，從而對其余兩因素間的交互作用對粗提液中巰基活性進行分析與評價。

由圖5可知，因素A（料液比）對粗提液中巰基活性的影響最為顯著，所呈現的曲線較陡。相比之下，其它兩個因素提取強度與提取時間的曲線表現得較為緩和，影響較小。

2.2.4 驗證實驗 根據優化后得到的工藝參數，修訂后做3組平行實驗進行驗證，料液比為1∶16（m∶V），提取時間為32 min，提取強度為287 W，熱處理時間為8 min，進行超聲波提取，測定其巰基活性。測得粗提液的巰基活性的平均值為0.162μmol／L，與理論值0.167μmol／L接近。可見，該模型是可靠的。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

＊＊表示極顯著（P＜0.01），＊表示顯著（P＜0.05）。

來源 方差 自由度 均方 F值 P值 顯著性A 0.000 45 1 0.000 45 112.5 0.000 129 ＊＊B 0.000 018 1 0.000 018 4.5 0.087 359 C 0.000 018 1 0.000 018 4.5 0.087 359 A 2 0.001 667 1 0.001 667 416.826 9 0.000 1 ＊＊AB 0.000 049 1 0.000 049 12.25 0.017 284 ＊AC 9.00E－06 1 9.00E－06 2.25 0.193 904 B2 0.000 083 1 0.000 083 20.826 92 0.006 037 ＊＊BC 0.000 081 1 0.000 081 20.25 0.006 4 ＊＊C2 0.000 168 1 0.000 168 42.057 69 0.001 3 ＊＊回歸模型 0.002 418 9 0.000 269 67.159 26 0.000 111 ＊＊一次項 0.000 486 3 0.000 162 40.5 0.000 624 ＊＊二次項 0.001 793 3 0.000 598 149.394 4 0.000 1 ＊＊交互項 0.000 139 3 0.000 046 11.583 33 0.010 905 ＊總誤差 0.000 02 5 4.00E－06失擬項 0.000 018 3 6.00E－06 6 0.146 185純誤差 2.00E－06 2 1.00E－06總和 0.002 438 14

圖5 交互作用對粗提液中巰基活性的影響Figure 5 Effect of the crude extracts thiol activity on interaction

3 結論與討論

本試驗在單因素試驗的基礎上進行3因素3水平Box－Behnken試驗設計，對超聲波輔助提取酵母源類金屬硫蛋白的工藝進行優化，得到提取最佳工藝參數為料液比1∶16（m∶V），提取時間32 min，提取功率287 W，熱處理時間8 min。該條件下得到的金屬硫蛋白巰基活性達0.162μmol／L，提高了金屬硫蛋白的產量，縮短了提取時間，對今后的酵母源類金屬硫蛋白的工業化生產具有一定的指導意義。

在金屬硫蛋白的提取過程中，料液比即提取液濃度對提取結果的影響是極顯著的（P＜0.01），高濃度的提取液不利于金屬硫蛋白的提取，濃度降低到一定程度后，金屬硫蛋白的含量變化不顯著。這與黨蕊葉等［14］報道的兔肝金屬硫蛋白在低濃度Tris—HCl緩沖液中更穩定的結果相似。由于金屬硫蛋白具有強抗熱性［15］，所以將得到的粗提液于80℃水浴熱處理8 min，以消除雜蛋白尤其是含巰基蛋白對測定結果的影響，對后續的純化工藝也有積極的促進作用。

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