水解時間對玉米蛋白粉酶解物抗氧化活性的影響

楊 雙 鄭喜群 劉曉蘭 周利敏 馬艷秋

YANG Shuang 1，2 ZHENG Xi－qun 1，2 LIU Xiao－lan 1，2 ZHOU Li－min 1，2 MA Yan－qiu 1，2

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

（1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar，Heilongjing 161006，China；2.Key Constructive Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang，Province Normal University，Qiqihar，Heilongjing 161006，China）

玉米蛋白粉酶解獲得的酶解物，經物理處理后，可制備出具有多種生理功能的玉米肽，具有促進乙醇代謝［1］，消除運動后的疲勞［2］，降低血糖［3］和降血壓［4］等功能。玉米肽主要是分子量＜1 000 Da的短肽，可以被腸道內直接吸收，而且吸收速度要比游離氨基酸和蛋白質快2～3倍，從而更能發揮其生物功能［1］。

玉米肽的許多生理功能與其抗氧化活性有關，抗氧化活性主要是用于評價樣品清除自由基的能力。要想了解玉米肽的綜合抗氧化能力就要通過檢測玉米肽對O·、·OH、DPPH等自由基的清除能力，及其與Fe2＋的螯合能力和將Fe3＋還原成Fe2＋的能力。

復合蛋白酶（protamex）通常用作多種酶分步水解谷物蛋白的研究［5］，或者用于研究單酶水解谷物蛋白條件的優化［6］，以追求更大的水解度和可溶性蛋白含量，然而Protamex單獨水解谷物蛋白的可溶性蛋白含量較堿性蛋白酶或多酶復合水解效果低4倍以上，所以極少有學者研究Protamex單酶作用玉米蛋白的功能性質［5］，也未曾有報道表明前人有對Protamex酶解物做過如此全面的抗氧化活性研究。玉米蛋白的功能性質之一——抗氧化活性與其分子量分布密切相關［7］，所以本研究擬通過改變水解時間來控制Protamex水解玉米蛋白粉的水解度，制備出不同分子量分布的玉米肽［7］，并研究其抗氧化活性變化，探究水解時間對玉米肽抗氧化活性的影響，進而對Protamex酶解物的抗氧化活性的機制研究提供依據，也為提高這類原料的附加值，改善其功能特性，為開創良好的經濟和社會效益服務。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

玉米蛋白粉：黑龍江龍鳳玉米開發有限公司；

α－淀粉酶：酶活30 U／g，北京奧博星生物技術責任有限公司；

復合蛋白酶：食品級，酶活13.59萬U／g，由枯草桿菌發酵產生，諾維信公司；

三羥甲基氨基甲烷（Tris）：色譜純，上海生工生物股份有限公司；

其余藥品：均為實驗室常規分析純。

1.2 試驗儀器和設備

雙螺桿擠壓膨化機：DS32－Ⅱ型，上海躍進醫療器械廠；

722型紫外分光光度計：TU－1901型，上海精密科學儀器有限責任公司；

高速離心機：CF15RX型，北京醫用離心機廠；

集熱式磁力加熱攪拌器：DF－Ⅰ型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 樣品的制備和提取

1.3.1 玉米蛋白粉的預處理

玉米蛋白粉→過80目篩→擠壓膨化→去淀粉→去色素→預處理后蛋白粉

對玉米蛋白粉進行預處理主要是利用擠壓膨化的高溫、高壓和高剪切力的作用，使其結構發生變化，如其中蛋白質的三、四級結構的結合力變弱，分子間氫鍵、二硫鍵等部分斷裂，使物料形成結構相對疏松、多孔的膨化物料；另外，玉米蛋白粉中含有8%～10%的淀粉，與玉米蛋白緊密連接，形成層層包裹很難剝離開的復合體，也影響了玉米黃粉中蛋白的酶水解速度。所以酶解反應前采用一定的預處理方法使蛋白適當變性，破壞蛋白的高級結構，使玉米蛋白在分子內部的某些基團暴露在蛋白質分子的表面上，從而改善玉米蛋白粉的水溶性，增加蛋白酶對玉米蛋白的作用位點；有利于酶對玉米蛋白的水解。玉米蛋白粉預處理具體方法參照文獻［6］。

1.3.2 樣品酶解 底物濃度5%（m／V）（用微量凱氏定氮法測定預處理后的玉米蛋白粉蛋白含量是81.57%），調節料液的p H至7.0，溫度為60℃時，再加入0.81% （m／V）的Protamex（酶 活 13.59 萬 U／g），分 別 酶 解 15，30，60，90，120 min。酶解過程用2 M NaOH滴定保持p H恒定，記錄消耗NaOH的體積。酶解完成后于90℃水中滅酶10 min，4 000 r／min離心15 min，上清液再經定性濾紙（中速，型號102）過濾，即獲得玉米肽液，冷凍抽干制成玉米肽粉后于干燥器中保存［6］。不同水解時間制得樣品分別標記為P－15，P－30，P－60，P－90，P－120。1.4 水解相關指標測定

（1）酶活測定：按SB／T 10317—1999執行；

（2）水解度：p H－stat法［8］；

（3）可溶性蛋白含量：福林酚法［8］。

1.5 玉米肽的分子量分布

采用體積排阻色譜法，運用高分離度凝膠色譜預裝柱Superdex Peptide 10／300 GL（10×300～310 mm），及 Purifier100蛋白純化儀測定。流動相為 p H 7.0（20 mmol／L）含0.15 M NaCl 的 磷 酸—磷 酸 鹽 （PBS）緩 沖 液，流速0.25 m L／min，在波長214 nm下檢測。配制玉米肽濃度為2 mg／m L（標準曲線的標樣濃度為2 mg／m L），進樣前過0.22μm的微孔過濾膜，進樣量100μL。

1.6 抗氧化活性測定

玉米肽抗氧化的各指標測定中所用的樣品濃度均為10 mg／m L，充分溶解后4 000 r／min離心15 min，取上清液進行測試，并用0.05%的Vc作對照。每個樣品的每個指標平行測定3次，結果取平均值。

1.6.1 清除DPPH自由基的測定 根據Shimada等的方法［9］，修改如下：取2 m L 0.1 m M DPPH 無水乙醇溶液加入2 m L樣液里，混合均勻，避光反應30 min，在517 nm處測其吸光值為Ai；另取2 m L待測樣品于試管中，分別加入無水乙醇2 m L，避光反應20 min，在517 nm處測吸光值；以2 L 0.1 m M DPPH無水乙醇溶液和2 m L無水乙醇反應作為參比，測吸光值。其清除率計算：

式中：

K——對DPPH自由基的清除率，%；

A0——2 m L 0.1 m M 的 DPPH 無水乙醇溶液加2 m L無水乙醇的吸光值；

Ai——2 m L 0.1 m M 的 DPPH 無水乙醇溶液加2 m L待測樣品的吸光值；

Aj——2 m L無水乙醇加2 m L待測樣品的吸光值。

1.6.2 清除·OH的測定 采用鄰二氮菲—Fe2＋氧化法［10］。

（1）依 次 加 入 0.15 mmol／L PBS 1 m L、去 離 子 水0.5 m L搖勻；加入0.75 mmol／L FeSO40.5 m L，充分混勻；加入0.01%H2O20.5 m L，振蕩1 min；加入0.75 mmol／L鄰二氮菲無水乙醇溶液0.5 m L，37℃水浴60 min；在536 nm處檢測反應體系的吸光度值；

（2）以0.5 m L去離子水替代1.6.2（1）中的0.5 m L H2O2，其余條件同1.6.2（1），測其吸光度值；

（3）分別以不同玉米肽溶液（或 Vc）0.5 m L替代1.6.2（1）中的去離子水，測其吸光度值。清除率計算：

式中：

D——對·OH自由基的清除率，%；

AS——待測 樣 品 代 替 1.6.2（1）中 去 離 子 水 后在536 nm處的吸光值；

AP——反應體系在536 nm處的吸光值；

AB——用去離子水代替 H2O2參與1.6.2（1）反應時，其在536 nm處的吸光值；

式中：

I——抑制率，%；

V0——對照組鄰苯三酚自氧化速率，A／min；

VS——樣品組鄰苯三酚自氧化速率，A／min。

1.6.4 與鐵離子螯合能力的測定 根據 Kong等［12］的方法，修改如下：取0.5 m L的樣品溶液，加入1 m L 20μM FeCl2，混勻后加入0.5 m M 菲洛嗪（ferrozine）溶液1 m L，劇烈震蕩搖勻，室溫下靜置10 min，在563 nm處測定吸光值，以等體積去離子水取代樣品溶液作為對照所測吸光值。

式中：

R——螯合率，%；

A0——對照組參與以上反應后在563 nm處的吸光值；

AS——樣品組參與以上反應后在563 nm處的吸光值。

1.6.5 還原力測定 參照 Oyaizu等［13］的方法。

1.7 數據處理與分析

以上各項測定均做3次重復，用Excel軟件對試驗所得數據進行處理和分析。

2 結果與討論

2.1 水解時間對水解度及可溶性蛋白含量的影響

表1 Protamex水解時間對玉米蛋白粉水解度及可溶性蛋白含量的影響Table 1 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis of CGM and the content of soluble protein by protamex

由表1可知，Protamex在前15 min時作用效果較快，隨著水解時間的增加，水解度值和可溶性蛋白含量也隨之增大，但是15 min到120 min之間的水解度增長幅度很小，而可溶性蛋白含量最高增長了166.4%。由此看來，Protamex水解預處理后玉米蛋白粉的水解度和可溶性蛋白含量與水解時間呈正相關。水解度和可溶性蛋白含量在水解時間達到60 min后增長幅度緩慢，水解體系在進行到一定程度后會達到水解平衡，即使繼續延長水解時間其水解度和可溶性蛋白含量均可能不再增加，所以水解時間最大選在120 min，再延長水解時間意義不大。

2.2 水解時間對玉米肽的相對分子質量分布的影響

由表2可知，Protamex作用預處理后玉米蛋白粉15～120 min，分子量分布范圍較大，其中10～17 k Da的大分子蛋白含量呈減少趨勢；1 900～2 300 Da范圍內的蛋白含量與水解時間成負相關；Protamex作用玉米蛋白粉制得的主要組分是450～700 Da之間的短肽，并且短肽的含量與水解時間總體呈現正相關。可見，水解時間可以有效影響Protamex對預處理后玉米蛋白粉的作用，15～120 min期間可逐漸將1 900～10 000 Da的大分子肽轉化成＜700 Da的短肽，Protamex單獨作用玉米蛋白粉120 min所得＜700 Da的短肽含量可達88.74%。并且有研究表明，肽的抗氧化活性與相對分子質量大小有關［7］，活性較強抗氧化肽的氨基酸殘基數目一般在20個以內［14］。玉米肽的抗氧化能力與分子量密切相關，而分子量過大或過小其抗氧化能力均不能達到最好，但當玉米肽中的短肽含量適中，且含有某些能與自由基反應的特殊基團，即供氫基團，而只有當玉米肽分子量適中時這些特殊的供氫基團才能最大限度的被暴露出來并與自由基反應，體現更大的抗氧化活性［15，16］。

表2 水解時間對玉米肽分子量分布的影響Table 2 Effect of hydrolysis time on molecular weight distribution of corn peptide ／%

2.3 水解時間對玉米肽抗氧化活性的影響

圖1 水解時間對玉米肽抗氧化活性的影響Figure 1 Effect of hydrolysis time on antioxidant activity of corn peptide

2.3.2 對酶解物清除·OH能力的影響 由圖1可知，玉米肽清除·OH的能力與Protamex水解玉米蛋白粉的水解時間成正相關，并且在水解30 min時清除能力顯著加強，當水解 到 120 min 時 達 最 大 值 為 （19.82±0.90）%，是0.05%Vc清除能力的72.13%。雖然用此方法玉米肽對·OH的清除率值并不高，但是與Vc比較，玉米肽對·OH的作用還是比較強的，而·OH是已知的氧自由基中最強的氧化劑，它可以起動脂質過氧化反應，幾乎可以和所有細胞成分反應，對機體的危害極大。試驗表明，短肽占比多時對清除·OH有更好的效果，水解時間的延長可以促進更多與·OH結合的基團裸露出來。

2.3.3 對酶解物清除DPPH能力的影響 由圖1可知，玉米肽在清除DPPH的能力與Protamex水解玉米蛋白粉的水解時間無顯著相關性，不同水解時間樣品對DPPH自由基的清除均有較好的效果，水解15，30，60 min所制玉米肽都達到61%左右，且無顯著差異，在水解到90 min和120 min時有所增加，清除率達到67%左右，達到0.05%Vc清除率的70.1%。而DPPH是人工合成的大分子自由基，它的化學穩定性來自共振穩定作用及3個苯環的空間障礙，從而使夾在其中間氮原子上的未成對電子不能發揮其應有的電子成對作用。DPPH因具有單電子而使其在517 nm處有一強吸收（呈深紫色），當存在自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數成定量關系，因而可廣泛用于自由基清除劑和抗氧化劑的篩選分析［18］。較高的清除DPPH自由基的能力說明本試驗中的樣品具有較強的提供質子的能力，質子與自由基結合后就可以阻止自由基對機體細胞的氧化損傷。

2.3.4 對酶解物與Fe2＋的螯合能力的影響 由圖1可知，玉米肽顯示出了很強的與Fe2＋的螯合能力，在水解15 min時螯合率即可達到（82.08±0.43）%，但也體現出其螯合率與水解時間成反比關系，在水解到120 min時降至（74.44±1.95）%，而0.05%的 Vc卻沒有與Fe2＋螯合的能力。在這一點大大優于堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉制取的玉米肽，Kong等［12］研究表明堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉制取的玉米肽幾乎沒有與Fe2＋螯合的能力。這種較強的與Fe2＋螯合的能力可以使玉米肽抑制Fenton反應和Harber－Weiss反應，即：

從而減少·OH的產生，直接或間接減少了很多自由基的連鎖氧化反應，Protamex水解物獨具的與Fe2＋螯合的能力對其后續的功能性產品研發具有重要意義。

2.3.5 對酶解物還原能力的影響 由圖2可知，玉米肽的還原能力與水解時間有正相關趨勢，從水解15 min的0.145±0.001增加到120 min的0.217±0.002，而0.05%的Vc還原能力達到了0.788±0.007。玉米肽的還原能力遠遠低于0.05%Vc的效果。雖然Protamex酶解物的還原力相對不高，但是其仍然具備一定的提供電子的能力，對金屬離子引起的氧化起到一定的預防作用。

圖2 水解時間對玉米肽還原力的影響Figure 2 Effect of hydrolysis time on reduce power of corn peptide

3 結論

研究結果表明，Protamex的水解作用可有效改善玉米蛋白粉的溶解性，水解度和可溶性蛋白含量與水解時間均呈正相關；Protamex作用玉米蛋白粉的水解時間決定了酶解物的分子量分布，而酶解物的分子量分布不同體現了不同的抗氧化活性，然而并不是短肽的含量高就對各種自由基有較好的清除能力，分子量＜700 Da的玉米短肽含量占60%以上對清除DPPH自由基和與Fe2＋的螯合能力較強，而對清除O·能力和還原能力較弱，但是P－120的綜合抗氧化能力可與0.05%的Vc標準品相媲美。

自由基是機體正常代謝的產物，對于機體的正常代謝有一定的促進作用，但是機體內的自由基只能逐漸增多而不會缺失，過多的自由基會引起機體衰老、細胞損傷、死亡和組織傷害、細胞癌變等，所以適當的補充外源抗氧化劑對機體有特殊的意義。采用Protamex水解玉米蛋白粉2 h即可獲得高效、較綜合的抗氧化活性劑，這為玉米蛋白粉擁有更多良好的應用前景奠定了基礎。

1 Yamaguchi M，Takada M，Nozaki O，et al.Preparation of corn peptide from corn gluten meal and its administration effect on alcohol metabolism in stroke－prone spontaneously hypertensive rats［J］.J.Nutr.Sci.Vitaminol，1996，42（3）：219～231.

2 李晶.玉米肽抗疲勞作用的實驗研究［J］.食品與機械，2004，20（1）：11～12，27.

3 Mochida T，Hira T，Hara H.The corn protein，zein hydrolysate，administered into the ileum attenuates hyperglycemia via its dual action on glucagon－like peptide－1 secretion and dipeptidyl peptidase－IV activity in rats［J］.Endocrinology，2010，151（7）：3 095～3 104.

4 王俊彤，鄭喜群，劉曉蘭.酶解玉米黃粉制備降血壓肽的研究［J］.食品與機械，2013，29（3）：212～215.

5 王曉杰，鄭喜群，劉曉蘭.雙酶復合水解對玉米肽抗氧化活性的影響［J］.食品與發酵工業，2010（8）：102～105.

6 鄭喜群.玉米黃粉的酶解工藝與抗氧化活性肽的制備［D］.北京：中國農業大學，2006.

7 李向紅，陳志軍，劉永樂，等.鰱魚酶解產物分子質量組成與抗氧化性［J］.食品科學，2013，34（17）：28～32.

8 王曉杰，鄭喜群，胡立玉.雙酶分步水解時問對玉米肽功能性質的影響［J］.食品工業科技，2013，34（8）：223～227.

9 Shimada K，Fujikawa K，Yahara K，et al.Antioxidative properties of xanthan on the antoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion［J］.J.Agric.Food Chem.，1992，40（6）：945～948.

10 金鳴，蔡亞欣，李金榮，等.鄰二氮菲—Fe2＋氧化法檢測H2O2／Fe2＋產生的羥自由基［J］.生物化學與生物物理進展，1996，23（6）：553～555.

11 賈之慎，楊賢強.茶多酚（TP）清除活性氧自由基 O2－·和·OH的分光光度法研究［J］.中國茶葉，1993，19（1）：25～27.

12 Kong B H，Xiong Y L.Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action［J］.J.Agric.Food Chem.，2006，54（16）：6 059～6 068.

13 Barros L，Baptista P，Correia D M，et al.Effects of conservation treatment and cooking on the chemical composition and antioxidant activity of Portuguese wild edible mushrooms［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007， 55 （12）：4 781～4 788.

14 羅文峰，吳新亮，郭勇.烏骨雞多肽的體外抗氧化活性研究［J］.食品科技，2009，34（10）：200～204.

15 Tang X Y，He Z Y，Dai Y F，et al.Peptide fractionation and free radical scavenging activity of zein hydrolysate［J］.J.Agric.Food Chem.，2010，58（1）：587～593.

16 張曉峰，陳慶森，龐廣昌.玉米短肽的制備及其抗氧化活性的研究［J］.食品科學，2005，26（9）：33～35.

17 Halliwell B，Gutteridge J M.Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease：an overview［J］.Methods Enzymol，1989（186）：1～85.

18 Joshi G，Sultana R，Perluigi M，et al.In vivo protection of synaptosomes from oxidative stress mediated by Fe2＋／H2O2or 2，2－azobis－（2－amidinopropane）dihydrochloride by the glutathione mimetic tricyclodecan－9－yl－xanthogenate［J］.Free Radie.Biol.Med.，2005，38（8）：1 023～1 031.