硼替佐米聯(lián)合阿糖胞苷誘導(dǎo)對K562細(xì)胞株P(guān)TPROt基因的影響

（河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000）

慢性粒細(xì)胞白血病（CML）屬于骨髓增生性疾病，是惡性血液疾病中一種非常常見的類型。伊馬替尼（格列衛(wèi)）現(xiàn)已成為世界公認(rèn)的CML慢性期一線治療藥物，多數(shù)患者可獲得細(xì)胞遺傳學(xué)緩解[1]，但因其不能根除致病基因，目前無停藥指征，需終身服用。引起伊馬替尼對CML耐藥的原因有很多，其中最主要的便是BCR/ABL融合基因出現(xiàn)點(diǎn)突變和殘留的致病基[2－3]。當(dāng)然，BCR/ABL基因的擴(kuò)增，BCR/ABL染色體以外合并其他染色體突變等都是造成伊馬替尼療效不佳或耐藥的原因。目前在該病的治療藥物中，常采用第2代酪氨酸酶抑制劑，其臨床療效良好，但仍無法將致病基因徹底清除，且對于T315IBCR/ABL融合基因點(diǎn)突變，無法達(dá)到治療目的[3－4]。現(xiàn)在對該病的新治療方案探索已在實(shí)驗(yàn)室水平進(jìn)行，也有單位開始了早期臨床試驗(yàn)。我院實(shí)驗(yàn)室就硼替佐米聯(lián)合阿糖胞苷治療應(yīng)用于白血病細(xì)胞株進(jìn)行了試驗(yàn)，通過觀察其凋亡率，同時了解PTPROt基因在治療前后的表達(dá)變化，以進(jìn)一步探討硼替佐米誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

本次研究選用的材料為來源于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室長期液氮保存的白血病K562細(xì)胞株。

1.2 試驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)：在研究之前，首先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將目標(biāo)細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（美國Coulter公司）中，加入鏈霉素（100μg/mL）和青霉素（100U/mL）。在此過程中要注意培養(yǎng)孵育箱（德國Heraeus公司）的環(huán)境，要確保其溫度保持在37℃，同時要確保濕度的飽和以及二氧化碳的濃度符合標(biāo)準(zhǔn)，完成培養(yǎng)后選擇對數(shù)生長期具備活力細(xì)胞作為試驗(yàn)對象。

分組：將試驗(yàn)細(xì)胞分為6組。Ⅰ組先予阿糖胞苷（Ara－C，美國Promega公司，批號為H20100595）預(yù)處理6h后，予硼替佐米（BTZ，西安楊森制藥有限公司，批號為H20090822）；Ⅱ組先予BTZ預(yù)處理6h，再予Ara－C處理；Ⅲ組上述兩藥同時聯(lián)合應(yīng)用；Ⅳ組單用Ara－C；Ⅴ組單用BTZ組；Ⅵ組為空白對照組，不用任何處理。其中BTZ質(zhì)量濃度為15nmol/L，Ara－C質(zhì)量濃度為0.5μg/mL。觀察用藥48h的細(xì)胞情況。

酶聯(lián)免疫檢測細(xì)胞抑制率：用噻唑藍(lán)(MTT，20mL，5g/L，美國Sigma公司）干預(yù)K562細(xì)胞，在酶聯(lián)免疫檢測儀（哈爾濱東聯(lián)公司）于570nm波長處測量各孔的吸光度值（A值）。反復(fù)操作3次，根據(jù)細(xì)胞增殖抑制率的計算公式計算最終結(jié)果。

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：取對數(shù)生長期K562細(xì)胞，根據(jù)分組加入不同藥物培養(yǎng)72h，收集各組細(xì)胞，離心，用4℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入緩沖液重置，加入Annexin VFTTC（北京寶賽生物技術(shù)公司）5μL混勻，室溫避光反應(yīng)15min，應(yīng)用FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測細(xì)胞凋亡率。重復(fù)3次，計算平均值。

鏈擴(kuò)增(PCR)法檢測目標(biāo)基因表達(dá)：用Trizol提取處理細(xì)胞mRNA。所提取RNA于－80℃保存（日本SANYO公司生產(chǎn)低溫冰箱）或進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。半定量RT－PCR檢測PTPROtmRNA的表達(dá)，PTPROt上游引物5＇－AGAACCAGCTCCACCCAAAT－3＇，下游引物5＇－CTACAATTGTAGGCAGTGGC－3＇，引物系來自美國Promega公司。讀取結(jié)果和掃描，判定基因表達(dá)狀態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

將試驗(yàn)所得結(jié)果錄入SPSS17.0進(jìn)行分析處理。采用單因素方差法，并采用兩兩比較的方式對6個處理組進(jìn)行處理。設(shè)α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT 檢測結(jié)果

單藥與聯(lián)合用藥均可抑制細(xì)胞增殖，聯(lián)合用藥可協(xié)同抑制細(xì)胞增殖，其中Ⅰ組抑制率（吸光度值與抑制率成反比）作用最強(qiáng)，其次為Ⅲ組，再次為Ⅱ組。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，Ⅰ組與Ⅳ組、Ⅴ組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Ⅴ組與Ⅲ組、Ⅳ組兩兩相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

聯(lián)合用藥可使細(xì)胞凋亡率增加，Ⅰ組（先ARA－C后BTZ）的協(xié)同促細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ組分別與Ⅳ組、Ⅴ組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ組間相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組別所測吸光度值及凋亡率比較（）

表1 各組別所測吸光度值及凋亡率比較（）

組別Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組Ⅳ組Ⅴ組Ⅵ組F值P值n444444吸光度0.149 ± 0.064 0.435 ± 0.220 0.356 ± 0.130 0.882 ± 0.062 0.477 ± 0.218 1.093 ± 0.085 14.272 0.001凋亡率（%）84.3 ± 5.6 60.6 ± 4.9 78.0 ± 5.2 25.0 ± 3.4 28.6 ± 3.9 1.2 ± 0.8 16.486 0.000

2.3 PCR檢測結(jié)果

Ⅳ組無PTPROt基因表達(dá)，故剔除Ⅳ組及Ⅵ組，在單獨(dú)應(yīng)用濃度15nmmol/L的Ⅴ組可使PTPROt表達(dá)上調(diào)，聯(lián)合用藥可使PTPROt表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，提示兩藥聯(lián)合有協(xié)同作用。Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ組與Ⅴ組兩兩相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ組間兩兩相比無統(tǒng)計學(xué)差異。詳見表2及圖1、圖2。

表2 各組PTPROt基因表達(dá)比較

3 討論

自2004年，NCCN指南已將伊馬替尼列為初發(fā)、年輕CML患者的一線治療，但伊馬替尼等酪氨酸激酶抑制劑的特點(diǎn)是對造血干細(xì)胞不敏感。有研究提示，應(yīng)用干擾素和阿糖胞苷治療CML可取得一定效果[5]，但總體療效差強(qiáng)人意。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，采用協(xié)同藥物治療或采用新合成藥物具有良好的臨床效果，甚至能夠達(dá)到完全治愈的目標(biāo)[6]。

蛋白酶抑制劑可降解與泛素結(jié)合的蛋白質(zhì)，從而對蛋白酶起到抑制作用，最終阻礙腫瘤細(xì)胞的生長。蛋白酶的異常增多是造成腫瘤的重要原因，蛋白酶抑制劑可通過抑制蛋白酶體使相關(guān)蛋白表達(dá)升高，如P27，P21等升高，轉(zhuǎn)錄因子NF－κB活性升高，達(dá)到抗腫瘤的作用[7]。也有研究表明，蛋白酶降解通路與BCR/ABL轉(zhuǎn)化細(xì)胞中應(yīng)用硼替佐米抑制FOXO的表達(dá)有關(guān)。本研究中應(yīng)用硼替佐米同時聯(lián)合阿糖胞苷治療，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞凋亡，故硼替佐米單藥或聯(lián)合用藥可能是新的治療方向。

圖1 PTPROt基因表達(dá)情況

圖2 β－actin管家基因電泳

阿糖胞苷是嘧啶類抗代謝藥物，現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于治療急性髓性細(xì)胞白血病，但存在耐藥性的問題。目前多項研究表明，大劑量阿糖胞苷可大大提高其有效率，尤其是患者長期生存率提高。但毒副作用也更多，因此在血液病的治療中，應(yīng)將靶向治療藥物作為首選藥物，扭轉(zhuǎn)常用化學(xué)治療藥物的耐藥狀況。阿糖胞苷等細(xì)胞毒性藥物的抗腫瘤作用是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡完成的[6]，而腫瘤細(xì)胞凋亡與腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞毒性藥物敏感成正相關(guān)[8]。故在臨床中，應(yīng)用的化學(xué)治療藥物有限，就出現(xiàn)化學(xué)治療藥物需反復(fù)應(yīng)用，從而出現(xiàn)再發(fā)生耐藥情況，因此導(dǎo)致整體治療失敗。本試驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用硼替佐米及阿糖胞苷，在聯(lián)合應(yīng)用兩藥時細(xì)胞抑制率及凋亡率明顯升高。

PTPROt是僅在造血細(xì)胞中表達(dá)的一種候選腫瘤基因，在慢性淋巴細(xì)胞白血病及及原發(fā)結(jié)腸癌均被證實(shí)表達(dá)下降[9]。PTPROt可以去磷酸化并使BCR/ABL融合基因滅活，并使其下游靶點(diǎn)CRKL和STAT5磷酸化，確認(rèn)PTPROt有滅活BCR/ABL基因的作用。此外，PTPROt活性升高可以導(dǎo)致K562細(xì)胞延遲從G0/G1期向S期過渡，抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)其凋亡。PTPROt對BCR/ABL細(xì)胞的抑制作用在小鼠試驗(yàn)中亦被證實(shí)，PTPROt在K562細(xì)胞中表達(dá)下降，經(jīng)一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5－azacytidine治療后，其表達(dá)恢復(fù)[10]。本研究結(jié)果表明，硼替佐米單藥和聯(lián)合阿糖胞苷可使K562細(xì)胞凋亡，而僅用硼替佐米可使PTPROt的表達(dá)上調(diào)，提示硼替佐米可能通過上調(diào)PTPROt的表達(dá)而起抗腫瘤細(xì)胞作用，而是否通過去甲基化作用起抗腫瘤作用，可進(jìn)一步研究。

硼替佐米作為抗腫瘤藥物，在多項體外細(xì)胞試驗(yàn)中提示對腫瘤細(xì)胞存在促凋亡作用，尤其在與其他藥物協(xié)同用藥治療一些腫瘤細(xì)胞中取得了令人鼓舞的效果，在白血病治療中也不乏有序貫方案取得較好療效的報道。本試驗(yàn)中，阿糖胞苷與硼替佐米序貫處理K562細(xì)胞，效果更好，PTPROt基因的表達(dá)上調(diào)可能為硼替佐米作用于K562細(xì)胞促使細(xì)胞凋亡的原因之一，但其機(jī)制有待進(jìn)一步了解。總之，對于CML的治療，尤其是耐酪氨酸激酶抑制劑的患者，硼替佐米聯(lián)合阿糖胞苷或許是有效治療方案之一。

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