前處理及定量方法對奶粉中氯霉素含量測定結果的影響

周興旺 張繼紅 鄒 橋 張 麗

ZHOU Xing－wang ZH ANG Ji－hong ZOU QiaoZH ANG Li

（湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410117）

（Hunan Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research，Changsha，Hunan 410117，China）

氯霉素具有廣譜抗菌能力，曾被廣泛應用于動物養殖業，但氯霉素用于食用性動物會通過食物鏈傳遞給人類，人體長期食用含氯霉素的食物，會造成腸道正常菌群失調，并抑制骨髓造血功能［1－3］。中國農業部第235號公告《動物源性食品中獸藥最高殘留限量》中明確規定氯霉素禁止使用，在動物性食品中不得檢出。歐盟、美國的法規均明確規定在食品中“不得檢出”氯霉素。因此，準確測定奶粉中的氯霉素十分重要。目前，中國關于奶粉中氯霉素含量測定的文獻報道較少，任佳等［4，5］介紹的檢測奶粉中氯霉素的檢測方法，其前處理步驟長，且較復雜。中國也沒有相應的國家標準，中國各實驗室檢測奶粉中氯霉素的方法也沒有統一，關于不同樣品前處理方法及定量方法對測定結果的影響也未見報道。因此，比較分析不同前處理方法和定量方法對測定結果的影響對于準確測定奶粉中的氯霉素含量具有十分重要的意義。本研究擬參考中國常用的國家標準［6，7］，探討不同樣品前處理方法及定量方法對檢測結果精度的影響，旨在為廣大分析工作者和標準制修訂工作者提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

奶粉：為抽查購買的樣品（用方法A確定是陰性或陽性樣品），留作科研樣品用；

氯霉素標準品：純度98.5%，德國 Dr.Ehrenstorfer公司；

D5－氯霉 素 內 標 物：100ug／m L，德 國 Dr.Ehrenstorfer公司；

乙腈：色譜純，美國Tedia公司；

乙酸乙酯、正己烷、乙酸銨：國產分析純試劑；

液相色譜－三重四極桿串聯質譜儀：Thermo TSQ Ultra AM型，美國 Thermo Fisher公司；

色譜柱：Hypersil Gold型，美國 Thermo Fisher公司；

高速振蕩器：CUTE MIXER CM－1000型，日本 Tokyo Rikakakai公司；

離心機：TG16－WS型，湖南湘儀儀器開發公司；

漩渦混勻器：VORTEX－2型，美國 Scientific Industries公司；

氮吹儀：TTL－DCⅡ型，北京同泰聯科技發展有限公司；

電子天平：Sartouris BS224S型，北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同前處理方法

（1）前處理方法 A：參考 GB／T 22338－2008 中的5.3.1.1，稱 取 2 g 試 樣 至 50 m L 塑 料 離 心 管 中，加 入0.2 m L D5－氯霉素內標溶液（10 ng／m L）、10 m L 飽和氯化鈉、10 m L乙腈，漩渦混勻后高速震蕩提取5 min，以6 000 r／min離心10 min，上清液收集于玻璃管中，殘渣再加入5 m L乙腈重復提取1次，合并上清液于玻璃管中，60℃氮吹至約2 m L，加入乙腈飽和的正己烷除去脂肪，乙腈溶液繼續吹干，殘留物用1.0 m L乙腈水混合溶劑（20∶80）溶解，用0.22μm有機濾膜過濾后上機測定，內標法定量。

（2）前處理方法 B：參考 GB／T 22338－2008 中的5.3.1.1，與處理方法 A 基本一致，只是沒有加入飽和氯化鈉。

（3）前處理方法 C：參考 GB／T 22338－2008 中的5.3.1.3，稱取2.00 g試樣至50 m L塑料離心管中，加入2 m L水溶解樣品，并加入0.2 m L D5－氯霉素內標溶液（10 ng／m L）、10 m L 乙 酸 乙 酯，高 速 漩 渦 萃取 5 min，以6 000 r／min離心10 min，上清液收集于玻璃管中，殘渣再加入5 m L乙酸乙酯提取1次，合并提取液，乙酸乙酯提取液在60℃減壓旋轉濃縮至干，殘留物用2.0 m L乙腈溶解，加入乙腈飽和的正己烷除去脂肪，乙腈溶液繼續吹干，殘留物用1.0 m L乙腈水混合溶劑（20∶80）溶解，用0.22μm有機濾膜過濾后上機測定，內標法定量。

（4）前 處 理 方 法 D：參 考 SN／T 1864－2007 中 的2.4.2.a，基本與C處理方法一致，只是沒有加入2 m L水。1.2.2 定容溶劑的選擇 分別用純水、純乙腈和乙腈＋水混合溶劑（體積比＝20／80）配制氯霉素的標準使用液，并上機分析。

1.2.3 加標回收率試驗 稱取2.00 g陰性奶粉樣品，加入2 ng／m L的氯霉素標準溶液1 m L，然后按照 A、B、C、D 4種方法進行前處理，并用內標法定量。

1.2.4 不同定量方法的比較研究 將方法A處理的陽性樣品溶液，上機測定，分別用外標法和內標法進行定量分析。

1.3 測定條件

1.3.1 色譜參考條件 色譜柱：Hypersil Gold，150 mm×4.6 mm，3μm；流動相：5 m M 乙酸銨水溶液、水和乙腈，梯度條件見表1；流速：0.200 m L／min；進樣量：5μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Binary mobile phase composition program

1.3.2 質譜分析條件 采用電噴霧離子化源（ESI），通過負離子多反應檢測模式（MRM）對氯霉素及其內標物進行監測。噴霧電壓：2 500 V；蒸發溫度：300 ℃；鞘氣壓力：300 k Pa；掃氣壓力：0 Pa；輔助氣流量：5 L／min；毛細管溫度：350℃。定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量及去簇電壓見表2。

表2 氯霉素及內標物的質譜參數Table 2 Mass spectral parameters of chloramphenicol and internal standard

2 結果與討論

2.1 定容溶劑的選擇

氯霉素在乙腈的溶解性優于在純水中的，但流動相的初始條件中乙腈的含量約為20%，用純乙腈溶解的標準溶液，其總離子流色譜圖峰形不好，而用乙腈＋水的混合溶劑（20∶80）配制的標準溶液，其峰形較好（見圖1），這是由于色譜分析中的溶劑效應。另外，添加了少量乙腈的樣品定容液可以抑制微生物的生長，便于保存。因此，綜合考慮溶解性、峰形和保存的狀況，選擇乙腈和水的混合溶劑（20∶80）作為溶劑較好。

2.2 不同前處理方法對同一陽性樣品測定結果的影響

分別采用4種不同的處理方法對同一陽性樣品中的氯霉素進行測定，測定結果見表3。

由表3可知，方法A、C測定結果基本一致，而方法B和D均未檢出，說明不同前處理方法帶來的最終結果可能會顯著不同。

2.3 4種處理方法的加標回收率

為考察方法B、D測定結果是否由處理過程中的損失帶來的，本研究做了4種方法的加標回收率試驗。表4為采用不同處理方法的加標回收情況。

圖1 氯霉素及D5－氯霉素標準品總離子流色譜圖 （tr＝4.38 min）Figure 1 Total ion chromatogram of chloramphenicol and D5－chloramphenicol

表3 4種處理方法對同一陽性樣品的測定結果Table 3 Testing result of four pretreatment method for the same positive sample（n ＝3）

表3 4種處理方法對同一陽性樣品的測定結果Table 3 Testing result of four pretreatment method for the same positive sample（n ＝3）

未檢出：＜0.1μg／kg。

方法測定值／（μg·kg－1）1 2 3平均值／（μg·kg－1） RSD／%A 1.48 1.44 1.52 1.48 1.9 B 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 ／C 1.31 1.42 1.47 1.40 5.6 D 未檢出 未檢出 未檢出 未檢出 ／

表4 4種不同前處理方法的加標回收率比較Table 4 Mean recoveries for chloramphenicol in milk powder at the level of 1.0μg／kg（n ＝3）

由表4可知，4種處理方法回收率并無顯著差異。這說明表3的測定結果的差異并不是由樣品處理過程中目標物的損失引起的，而是由提取效果的差異而產生的。這也表明良好的加標回收率并不代表此方法能準確測定樣品中的某一組分。B、D法未能檢出氯霉素的結果說明，氯霉素在乙腈和乙酸乙酯中的溶解性雖然很好，但可能由于奶粉不溶于乙腈和乙酸乙酯，導致溶劑無法與目標物接觸，從而無法提取奶粉中的氯霉素。

2.4 兩種定量方法測定結果的比較分析

將方法A處理的陽性樣品分別用兩種定量方法測定，結果及精密度見表5。

表5 內標法和外標法測定結果比較Table 5 Comparison of determination results of chloramphenicol between internal standard and external standard methods

由表5可知，內標法的精密度優于外標法，其測定結果高于外標法，原因有二：① 樣品前處理造成目標物一定程度的損失，同位素內標法的校正因子可以校正這種損失，外標法無法校正這種損失；② 由于質譜定量分析的基質效應，相同濃度的樣品基質目標物信號值低于純標準溶液中目標物的信號值。而同位素內標法能很好地解決上述兩個問題，因此，選擇內標法定量測定奶粉中的氯霉素，其結果相對準確。

3 結論

本研究結果表明，加標回收率僅能體現試驗過程的目標物損失情況，而并不能體現對樣品中目標物的提取程度，但可為廣大分析工作者提供一種快速測定奶粉中氯霉素含量的檢測方法。該法用飽和氯化鈉水溶解奶粉，并用乙腈漩渦震蕩提取，內標法定量，可快速準確地測定奶粉中的氯霉素含量。

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6 國家質量監督檢驗檢疫總局.GB／T 22338－2008動物源食品中氯霉素類藥物殘留量的測定［S］.北京：中國標準出版社，2008.

7 國家質量監督檢驗檢疫總局.SN／T 1864－2007進出口動物源食品中氯霉素殘留量的檢測方法 液相色譜－串聯質譜法［S］.北京：中國標準出版社，2007.