免疫PCR方法快速檢測(cè)飲料中的赤蘚紅

龔 強(qiáng) 丁 利 肖家勇 羅斯斯 焦艷娜

GONG Qiang 1 DING Li 1 XIAO Jia－yong 1 LUO Si－si 2 JIAO Yan－na 1

朱紹華1 文江為1 付善良1 王利兵1

ZHU Shao－h(huán)ua 1 WEN Jiang－wei 1 FU Shan－liang 1 WANG Li－bing 1

（1.湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心食品安全科學(xué)技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

（1.Technology Center of Hunan Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hunan Key Laboratory of Food Safety Science and Technology，Changsha，Hunan 410004，China；2.Shanghai Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135，China）

合成色素即人工合成色素，用于食品中增加色澤的非營(yíng)養(yǎng)成分，主要以化工產(chǎn)品為原料經(jīng)有機(jī)反應(yīng)合成。這類色素大多具有一定毒性，包括毒性、致泄性、致癌性，其中偶氮化合物合成著色劑的致癌作用最為明顯［1，2］，中國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》明確規(guī)定了合成色素的使用品種和使用量，其他國(guó)家也均嚴(yán)格控制其應(yīng)用范圍和使用量［3，4］。飲料中添加合成色素的現(xiàn)象較為常見，超范圍、超劑量使用情況也時(shí)有報(bào)道，對(duì)人們的健康安全存在很大隱患。因此檢測(cè)飲料中合成色素的含量具有重要意義。

目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、文獻(xiàn)［5，6］報(bào)道中合成色素的檢測(cè)主要為高效液相色譜法，偶有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法報(bào)道［2］，方法前處理較為繁瑣。1992年Sano等［7］將免疫反應(yīng)中抗原抗體反應(yīng)的高度特異性與PCR技術(shù)中的高靈敏度、高擴(kuò)增效能結(jié)合起來，開發(fā)了免疫－PCR技術(shù)（immuno polymerase chain reaction，IPCR）。已有報(bào)道［8－12］表明該方法在致病微生物檢測(cè)、腫瘤標(biāo)記物追蹤、細(xì)胞因子分析以及毒素定量等生物技術(shù)領(lǐng)域獲得了較好的研究效果，但該方法應(yīng)用于食品科學(xué)中小分子物質(zhì)的檢測(cè)還鮮有報(bào)道［13］。赤蘚紅是合成色素中的一種，常用于飲料。本試驗(yàn)以赤蘚紅作為研究對(duì)象，采用免疫PCR方法，建立飲料中赤蘚紅的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)低限為10.0 fg／g，適用于不同飲料中赤蘚紅及其他合成色素的痕量、快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑

4 －（N－馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷－1－羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（Sulfo－SMCC）、戊二醛、牛血清白蛋白（BSA）、吐溫－20：美國(guó)Sigma－Aldrich公司；

NaCl、EDTA：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

赤蘚紅多克隆抗體：江南大學(xué)食品安全科學(xué)研究所；

超濾管：截留分子量10，30 K，美國(guó)Millipore公司；

SYBR?Premix EX Taq TM Ⅱ熒光PCR試劑盒：日本Takara公司；

其他試劑：除另有規(guī)定外，均為分析純?cè)噭?/p>

試驗(yàn)用水：超純水。

1.1.2 DNA分子（Takara合成）

上游引物：5’－GGGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT－3’；

下游引物：5’－GCCGAAAAATCTGGAAGGTC－3’；

5 ’端 巰 基 修 飾 探 針 （89 bp ssDNA）：5’－SH－GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CATTAGTCCT AGACAACGTT ACTATAACGT GAATGTAATG AACCTACAAG ACCTTCCAGA TTTTTCGGC－3’。

1.2 儀器

熒光定量PCR儀：PRISM 7000型，美國(guó)生物公司；

振蕩器：SA300 Shaker型，日本Yamato公司；

微孔板振蕩器：THERMO Star型，美國(guó) Bmg Labtech公司；

離心機(jī)：Beckman Coulter型，德國(guó)貝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA－赤蘚紅抗體偶聯(lián)物的制備 2.5 mg雙異功能團(tuán)偶聯(lián)劑Sulfo－SMCC溶解于1 m L超純水，取10μL溶于980μL PBS緩沖液（含 150 m M NaCl）中，加入 20μL 80μg／m L赤蘚紅抗體溶液，室溫振蕩反應(yīng)30 min，用截留分子量為10 K的超濾管對(duì)反應(yīng)混合物物進(jìn)行超濾（水平轉(zhuǎn)子，5 000 r／min離心50 min），除去多余的偶聯(lián)劑。截留物用990μL PBS緩沖液（含5 m M EDTA）復(fù)溶，加入10μL 1.0μM ssDNA，室溫振蕩反應(yīng)30 min，反應(yīng)混合物用截留分子量30 K的超濾管進(jìn)行超濾，除去未結(jié)合的DNA。截留物再用1 m L PBS（含5 m M EDTA）溶解，溶解產(chǎn)物即為DNA－赤蘚紅抗體偶聯(lián)物。

1.3.2 抗原包被PCR管 熒光定量PCR管用50μL 0.8%的戊二醛溶液37℃包被5 h，超純水振蕩洗滌PCR管3次，每次5 min；50μL 0.3μg／m L的赤蘚紅抗原包被PCR管，37℃包被2 h，100μL p H 7.2 PBST（含0.05%Tween－20 PBS）緩沖液振蕩洗滌3次，每次3 min，再用100μL p H 7.2封閉液（含1%BSA的PBS緩沖液）37℃封閉2 h，上述PBST緩沖液振蕩洗滌3次，每次3 min。

1.3.3 免疫傳感器的構(gòu)建 取上述包被好PCR管，加入25μL 10倍梯度稀釋濃度系列的赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品（濃度從0.05～50.0 pg／m L），每管中分別再加入25μL DNA－赤蘚紅抗體偶聯(lián)物，標(biāo)準(zhǔn)品中的赤蘚紅與PCR管壁上包被的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，37℃反應(yīng)30 min，用PBST緩沖液振蕩洗滌3次，每次3 min，最后將PCR管在吸水紙上拍打干凈。加入SYBR?Premix EX Taq TM Ⅱ2×Buffer 10μL，上游引物、下游引物各0.8μL，ROX Reference Dye 0.4μL，滅菌蒸餾水補(bǔ)足到20μL。熒光定量PCR儀測(cè)定。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。獲得偶聯(lián)DNA的擴(kuò)增曲線、熔解曲線。

1.3.4 樣品檢測(cè) 選取市售飲料作為檢測(cè)研究對(duì)象，樣品用超純水稀釋1 000倍，過0.22μm濾膜后直接進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性免疫PCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品Ct曲線計(jì)算濃度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光PCR檢測(cè)

熒光定量PCR采用SYBR?GreenⅠ嵌合熒光染料，從溶解曲線上可見78℃處有單一峰，無非特異性擴(kuò)增及引物二聚體（見圖1）。試驗(yàn)中的SYBR?Premix EX Taq TM Ⅱ熒光PCR試劑采用SYBR?GreenⅠ嵌合熒光染料，能夠在較寬的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確地定量，具有抑制非特異性反應(yīng)、再現(xiàn)性好的特性。

圖1 熒光PCR溶解曲線Figure 1 Dissociation curve of fluorescence PCR

2.2 驗(yàn)包被原、DNA－抗體偶聯(lián)物濃度的優(yōu)化

包被原和DNA－抗體偶聯(lián)物的濃度比例按照ELISA棋盤法進(jìn)行優(yōu)化，包被原的濃度參照普通ELISA的包被濃度，從1.0μg／m L 10倍梯度稀釋至0.01 ng／m L，抗體－DNA偶聯(lián)物（抗體 40.0 ng／m L、DNA 40 n M）2倍梯度稀釋至1.0 ng／m L（以抗體濃度計(jì)），加入同樣濃度的赤蘚紅進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，根據(jù)同一條件下加入目標(biāo)物和未加目標(biāo)物循環(huán)數(shù)的差值，選取最合適的濃度配比。擴(kuò)增效率越高，循環(huán)數(shù)差值越大，最終確定包被原濃度0.2μg／m L，抗體濃度10.0 ng／m L，DNA濃度10 n M。

2.3 方法線性范圍與檢測(cè)低限

固定包被原濃度0.2μg／m L、抗體濃度10.0 ng／m L、DNA濃度10 n M，優(yōu)化競(jìng)爭(zhēng)性赤蘚紅濃度：從5.0μg／m L 10倍梯度稀釋至5.0 fg／m L，試驗(yàn)結(jié)果表明：Ct值隨著加入標(biāo)準(zhǔn)品赤蘚紅濃度的增加而增大（見圖2），當(dāng)赤蘚紅濃度大于0.5 ng／m L時(shí)，Ct值與空白對(duì)照（不加赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品）無明顯差異。以濃度為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.05～50.0 pg／m L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（見圖3），線性方程為y＝0.336x＋11.69，相關(guān)系數(shù)為0.995 0，檢測(cè)底限為10.0 fg／m L。線性范圍為0.05～50.0 pg／m L，赤蘚紅濃度為0.05，0.5，5.0，50.0 pg／m L時(shí)對(duì)應(yīng)的Ct值分別為12.03，12.39，12.66，13.06，相關(guān)系數(shù)為0.995 0。

圖2 競(jìng)爭(zhēng)性赤蘚紅線性范圍免疫PCR擴(kuò)增圖Figure 2 Linear Immuno－PCR amplification of competitive erythrosine

圖3 赤蘚紅免疫PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 3 Standard curve of erythrosine by Immuno－PCR

2.4 方法的回收率與精密度

采用市售空白飲料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，選擇高、中、低（50.0，2.0，0.05 pg／m L）3個(gè)濃度，按照上述方法分別進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加濃度平行測(cè)定6次，取平均值計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度。由表1可知，方法平均回收率為60%～120%，精密度＜20%，回收率高，重復(fù)性好。

表1 陰性樣品添加回收率和精密度Table 1 Recoveries and precisions of negative samples（n ＝6）

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

對(duì)市售10種飲料分別采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（液相色譜法）和本方法進(jìn)行檢測(cè)，其中1份陽性樣品重復(fù)檢測(cè)6次（見表2），采用方差分析，P＜0.05，表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果相比較無顯著差異。

表2 陽性樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of positive sample／（mg·L－1）

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對(duì)免疫PCR方法條件的優(yōu)化、空白樣品的添加回收試驗(yàn)以及實(shí)際樣品的檢測(cè)，建立了飲料中赤蘚紅的免疫PCR快速檢測(cè)方法，方法快速、簡(jiǎn)便，與常規(guī)液相色譜法比較檢測(cè)結(jié)果無顯著差異。所建立的方法適合用于飲料中赤蘚紅的快速檢測(cè)。

1 阮麗萍，吉文亮，劉華良，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中10種合成著色劑［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2011，23（2）：151～154.

2 李邦銳，馮家力，潘振球，等.高效液相色譜－質(zhì)譜／質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定飲料中的人工合成色素［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（4）：579～581.

3 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB2760－2011食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

4 葛宇.食品中人工合成色素使用法規(guī)及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展［J］.質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)化，2011（9）：31～35.

5 米迎波，黃蔚，劉國(guó)，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定糕點(diǎn)中4種食用合成色素［J］.食品與機(jī)械，2011，27（4）：151～154.

6 咸瑞卿，王小兵，李啟艷，等.固相萃取－高效液相色譜－二極管陣列檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定飲料中10種合成著色劑［J］.現(xiàn)代食品科技，2013，29（6）：1 413～1 416.

7 Sano T，Smith C L，Cantor C R.Immuno－PCR：very sensitive antigen detection by means of specific antibody－DNA conjugates［J］.Science，1992，258（5 079）：120～122.

8 Saito K，Kobayashi D，Sasaki M，et al.Detection of human serum tumor necrosis factor－alpha in healthy donors，using a highly sensitive immuno－PCR assay［J］.Clin Chem.，1999，45（5）：665～669.

9 Sanna P P，Weiss F，Samson M E，et al.Rapid induction of tumor necrosis factor alpha in the cerebrospinal fluid after intracerebroventricular injection of lipopolysaccharide revealed by a sensitive capture immuno－PCR assay［J］.Proc Natl Acad Sci.U S A，1995，92（1）：272～275.

10 Zhang W，Bielaszewska M，Pulz M，et al.New immuno－PCR assay for detection of low concentrations of shiga toxin 2and its variants［J］.J.Clin Microbiol，2008，46（4）：1 292～1 297.

11 Chye S M，Lin S R，Chen Y L，et al.Immuno－PCR for detection of antigen to Angiostrongylus cantonensis circulating fifthstage worms［J］.Clin Chem.，2004，50（1）：51～57.

12 Hasan S，Dong J，Hara Y，et al.Protein－based open sandwich immuno－PCR for sensitive detection of small biomarkers［J］.A－nal Sci.，2013，29（9）：871～876.

13 Yin H，Zhu Y，Xu L，et al.Ultrasensitive detection of melamine based on a DNA－labeled immunosensor［J］.Biosens Bioelectron，2013（42）：51～55.