五種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法驗證

楊育林，吉瑩潔

(洛陽市食品藥品檢驗所，河南 洛陽 471023)

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五種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法驗證

楊育林，吉瑩潔

(洛陽市食品藥品檢驗所，河南 洛陽 471023)

目的：建立五種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法。方法：采用常規(guī)法、薄膜過濾法對五種醫(yī)院制劑進(jìn)行方法驗證。結(jié)果：椎間盤丸、頑痹康丸、芪仲腰舒丸可采用常規(guī)法，頸痛消丸、骨炎托毒丸須用薄膜過濾法除去其抑菌作用后方可進(jìn)行微生物限度檢查。結(jié)論：確立了五種醫(yī)院制劑微生物限度檢查方法，可有效控制其質(zhì)量。

醫(yī)院制劑；微生物限度檢查；方法驗證

微生物限度是藥品安全性的重要指標(biāo)之一，1995年版《中國藥典》 首次收載微生物限度檢查法，此后的三版藥典均對其進(jìn)行了較大幅度的修訂、增訂，為其結(jié)果的可靠性提供了保障。然而現(xiàn)行的各類藥品標(biāo)準(zhǔn)所收載的各中藥制劑品種檢查項下，很少規(guī)定具體的微生物限度檢查方法，這就要求我們對所采用的檢測方法進(jìn)行驗證試驗，確保該方法的可靠性。椎間盤丸、頑痹康丸、芪仲腰舒丸、頸痛消丸、骨炎托毒丸是河南省洛陽正骨醫(yī)院臨床使用廣泛的五種中藥制劑，本文參考有關(guān)資料[1-5]，對其微生物限度檢查方法進(jìn)行考察，為以后檢驗提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 供試品

椎間盤丸(批號：20130604)、頑痹康丸(批號：20130203)、芪仲腰舒丸(批號：20130104)、頸痛消丸(批號：20130106)、骨炎托毒丸(批號：20130602)，均為河南省洛陽正骨醫(yī)院生產(chǎn)。

1.2 菌種

大腸埃希菌(CMCC(B) 44 102)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B) 26 003)、枯草芽孢桿菌(CMCC(B) 63 501)、白色念珠菌(CMCC(F) 98 001)、黑曲霉菌(CMCC(F) 98 003)均由河南省食品藥品檢驗所提供。

1.3 培養(yǎng)基與稀釋液

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)；0.9%無菌氯化鈉溶液、pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液由本所配制。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌與枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成50～100cfu/mL的菌懸液。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24～48h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成50～100cfu/mL的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)1周，加入3～5mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子菌液至滅菌試管內(nèi)，用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成50～100cfu/mL的孢子懸液。

2.2 供試液制備

取供試品10g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100mL，制成1∶10的供試液。

2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證

2.3.1 試驗組 常規(guī)法：取1∶10供試液1mL，分別人工接種50～100cfu上述5種陽性試驗菌株，立即傾注15～20mL瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)至規(guī)定時間，觀察結(jié)果。薄膜過濾法：取1∶10供試液10mL， 以500r/min離心3min，取1mL上清液加入薄膜過濾器中，過濾后用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300mL分3次沖洗。在最后一次沖洗液中加入50～100cfu試驗菌株，濾干，取出薄膜貼于瓊脂培養(yǎng)基上，規(guī)定溫度培養(yǎng)至規(guī)定時間，觀察結(jié)果。

2.3.2 菌液組 按試驗組各方法不加供試液操作，測定所加菌數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 陽性菌計數(shù) (cfu/mL)

2.3.3 供試品對照組 取供試液1mL，按試驗組操作，不加菌液，記錄菌落數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對照組 取稀釋液1mL代替供試液，按試驗組操作，記錄菌落數(shù)。

2.3.5 回收率計算 試驗組的菌回收率(%)=(試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%;稀釋劑對照組的菌回收率(%)=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)×100%;依法計算回收率，稀釋劑對照組的菌回收率均高于70%，試驗組的菌回收率見表2/表3。

表2 常規(guī)法試驗組菌的平均回收率 (%)

表3 薄膜過濾法試驗組菌的平均回收率 (%)

2.4 控制菌檢查方法驗證

取4瓶膽鹽乳糖培養(yǎng)基(100mL/瓶)，其中3瓶分別加入1∶10 供試液10mL，一瓶作為樣品組，另一瓶加入50～100cfu大腸埃希菌作為陽性對照組，第三瓶加入50～100cfu金黃色葡萄球菌作為陰性菌對照組；剩余一瓶加入10mL稀釋劑作為陰性對照；置35℃培養(yǎng)18～24h后，進(jìn)行MUG及靛基質(zhì)試驗，結(jié)果見表4。

表4 控制菌方法驗證結(jié)果

3 討論

由表2可見，采用常規(guī)法時椎間盤丸、頑痹康丸、芪仲腰舒丸對各試驗菌的回收率均高于70%，證明無明顯抑菌現(xiàn)象；而頸痛消丸和骨炎托毒丸對某些試驗菌的回收率低于70%，說明其有明顯的抑菌作用,因此，應(yīng)重新驗證。從表3可以看出，在改用薄膜過濾法后，頸痛消丸和骨炎托毒丸對各試驗菌的回收率均高于70%，表明其抑菌作用已消除。由表4可以看出，各供試品對控制菌無明顯抑制作用。

根據(jù)以上分析，可以確立椎間盤丸、頑痹康丸、芪仲腰舒丸采用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌數(shù)的檢查，頸痛消丸和骨炎托毒丸采用薄膜過濾法進(jìn)行細(xì)菌數(shù)的檢查；上述五種醫(yī)院制劑的霉菌及酵母菌數(shù)檢查和控制菌檢查均可采用常規(guī)法進(jìn)行。

驗證試驗時，試驗用菌株的傳代次數(shù)不宜超過5代，并應(yīng)采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證其生物學(xué)特性。菌液制備后應(yīng)在規(guī)定期限內(nèi)使用，菌數(shù)應(yīng)符合藥典要求。

藥典收載的離心沉淀法僅適用于制備細(xì)菌計數(shù)或控制菌檢查用的供試液，500r/min離心3min只用于去除供試液中的沉淀物，不宜采用高速或長時離心沉降集菌，以免影響供試品中微生物的回收，造成檢驗結(jié)果不能真實反映供試品的污染情況。

測定回收率時，供試液加入菌液后，應(yīng)及時傾注培養(yǎng)基，以避免有抑菌性的供試液對菌液中的活菌造成損害，影響回收率。

[1] 國家藥典委員會. 中國藥典(一部)[S]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄79-88.

[2] 中國藥品生物制品檢定所,中國藥品檢驗總所. 中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:351-407.

[3] 蘇德模,馬續(xù)榮. 藥品微生物學(xué)檢驗技術(shù)[M]. 北京:華齡出版社,2007:221-227.

[4] 宋勤,杜平華. 中成藥微生物限度檢查方法的探討[J]. 中國藥事,2006,20(1):46-48.

[5] 楊靜. 藥品微生物限度檢查法的影響因素分析[J]. 中國藥事,2008,22(12):1095-1096.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

Verification of Methodology on the Microbial Limit Test for Five Hospital Preparations

Yang Yulin，Ji Yingjie

(Luoyang Institute for Food and Drug Control, Henan 471023, China)

Objective:To establish methods of the microbial limit test for five hospital preparations. Methods:Common method and membrane filtration method were used for the verification of methodology on five hospital preparations. Results:The results suggested that common method be used for Zhuijianpan pills, Wanbikang pills and Qizhongyaoshu pills; membrane filtration method for Jingtongxiao pills and Guyantuodu pills. Conclusion:Methods of the microbial limit test for five hospital preparations were established, and its can be used for quality control of those preparations.

Hospital Preparations; Microbial Limit Tests; Verification of Methodology

2014-08-20

楊育林(1978-)，男，河南省洛陽市食品藥品檢驗所主管藥師，研究方向為藥品檢驗。

R283

A

1673-2197(2014)23-0024-02