芪術(shù)鼻噴霧劑澄清工藝研究

賀寶瑩，楊紅梅，王聰穎，唐安玲，宋 英

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

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芪術(shù)鼻噴霧劑澄清工藝研究

賀寶瑩1，楊紅梅1，王聰穎1，唐安玲1，宋 英2*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

目的：優(yōu)選芪術(shù)鼻噴霧劑最佳澄清工藝。方法：以毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量、總黃酮含量、澄清度為評價指標(biāo)，選擇最佳澄清工藝，并進行優(yōu)化。結(jié)果：芪術(shù)鼻噴霧劑優(yōu)選澄清工藝為：采用醇沉方法澄清處理，藥液相對密度為1.05，醇沉濃度為60%，攪拌速度為300r/min。結(jié)論：優(yōu)選的澄清工藝合理可行，重復(fù)性好，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

鼻噴劑；澄清工藝；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；總黃酮

芪術(shù)鼻噴霧劑為臨床經(jīng)驗方，由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、桂枝、鵝不食草等中藥材組成，具有益氣固表、通竅攝涕之功效，可用于治療過敏性鼻炎，療效甚好。該處方確定的制劑提取方法為白術(shù)、防風(fēng)、桂枝、鵝不食草提取芳香水，藥渣與其它藥材加水提取。水提過程采用水煎煮方式提取有效成分,同時也溶出了淀粉、黏液質(zhì)、蛋白質(zhì)、樹脂、鞣質(zhì)等無效成分，如不除去會影響制劑質(zhì)量[1]。為提高制劑質(zhì)量,本實驗以毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量、總黃酮含量、澄明度作為質(zhì)量考察標(biāo)準(zhǔn),對不同純化方法進行比較,以優(yōu)選最佳澄清工藝。

1 儀器與試劑

1.1 實驗儀器

HP-1100高效液相色譜儀；Agilent Chem Station色譜工作站(美國Agilent公司)；UV-210紫外分光光度儀(日本島津公司)；JA2003上海電子天平(上海精科天平)；BP211D分析天平(十萬分之一型，德國賽多利斯公司)。

1.2 試劑

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號：111920-201203，購于中國食品藥品檢定研究院，含量為97.3%)；蘆丁對照品(批號：100080-200707，購于中國食品藥品檢定研究院，含量為92.5%)；色譜甲醇(美國天地公司)；重蒸餾水(實驗室自制)；其它試劑均為分析純。

藥材均購自四川省新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)醫(yī)院質(zhì)檢部鑒定符合2010版《中國藥典》及《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》中相關(guān)要求。

2 實驗部分

2.1 澄清工藝優(yōu)選

將水提驗證藥液濃縮至生藥，藥液比為1∶1.5，分別采用離心、60%醇沉、ZTC澄清劑澄清、明膠法進行純化。

2.1.1 離心法 取濃縮液50mL,離心(4 000轉(zhuǎn)/min)20min，上清液定容至50mL。

2.1.2 醇沉法 取濃縮液50mL，加乙醇使含醇量達(dá)到60%，靜置，抽濾，回收乙醇，藥液定容至50mL。

2.1.3 ZTC澄清劑澄清 取濃縮液50mL，加水稀釋至生藥，藥液比為1∶1.5；加入6%藥液量的1%澄清劑B組分，2h后緩緩加入6%藥液量的1%澄清劑A組分，靜置6h，濾過即得。

2.1.4 明膠法 取濃縮液50mL，加入5%明膠至無沉淀產(chǎn)生，靜置，濾過；加乙醇使含醇量達(dá)到70%，靜置，抽濾，回收乙醇，藥液定容至50mL。

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定

2.2.1 色譜條件[2]參照高效液相色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄VIB)測定。

色譜條件：HP1100型液相色譜儀；Boston pHLex ODS(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱；按表1進行梯度洗脫，其中乙腈為流動相A，0.2%的甲酸溶液為流動相B；檢測波長為260nm；流速為1mL·min-1；柱溫為30℃。理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計算，應(yīng)不少于3 000。

表1 梯度洗脫指標(biāo)

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品3.26mg，置50mL容量瓶，加甲醇，定容搖勻，即得(0.063 44mg·mL-1)。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取對照品溶液0.5、1、3、5、7μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進樣量(X)為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y =30 985X+6.699 7，R2=0.999 9，表明進樣量在0.003 172～0.444 1μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 供試品溶液制備 精密量取樣品溶液2mL，置10mL容量瓶，加甲醇，定容搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按“2.2.1”項色譜條件，精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷。結(jié)果見表2。

2.3 總黃酮含量測定[3]

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取蘆丁對照品4.01mg，置10mL容量瓶，加60%甲醇，定容搖勻，即得(0.370 9mg·mL-1)；取蘆丁對照品溶液，精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置10mL容量瓶，加60%甲醇，定容搖勻。分別取上述溶液適量，置比色皿中，在265nm波長處測定吸光度A。以吸光度A為縱坐標(biāo)(Y)，總黃酮含量C為橫坐標(biāo)(X)，得回歸方程為：Y=9.086 0X+0.063 2，r=0.998 8，表明進樣量在 0.007 418～0.037 09mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 供試品溶液制備 取純化樣品溶液，精密吸取1mL，置100L容量瓶，加水定容后，濾過，精密吸取續(xù)濾液10mL，加甲醇定容至25mL容量瓶，即得。分別取上述供試品溶液適量，置比色皿中，在265nm波長處測定吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計算總黃酮含量。結(jié)果見表2。

表2 濃縮純化試驗結(jié)果 (mg·g-1)

結(jié)果顯示：在所篩選的各純化方法中，以醇沉法和明膠法較澄清，醇沉損失相對較小，故確定醇沉方式作為純化工藝。

2.4 正交設(shè)計優(yōu)選醇沉工藝[4-5]

2.4.1 水平因素表 選用L9(34)正交試驗表,以總黃酮、毛蕊異黃酮含量為指標(biāo),根據(jù)醇沉的影響因素,考慮藥液相對密度、乙醇濃度和攪拌速率等，設(shè)計水平因素表。見表3。

表3 水平因素

2.4.2 正交實驗結(jié)果 結(jié)果顯示：影響醇沉效果的各因素大小順序為：B(醇沉濃度)>C(攪拌速度)>A(藥液相對密度)，優(yōu)選的工藝為B3C3A1，即藥液相對密度為1.05，醇沉濃度為50%，攪拌速度為300r/min。經(jīng)方差分析，B(醇沉濃度)有顯著性影響，因素A無顯著性影響，由于50%醇沉液外觀較混濁，故確定的醇沉工藝條件為：B2C3A1，即藥液相對密度為1.05，醇沉濃度為60%，攪拌速度為300r/min。試驗結(jié)果見表4，方差分析見表5。

2.4.3 驗證試驗 為驗證實驗結(jié)果，以保證提取工藝的合理可靠，按上述確定試驗方法，進行驗證試驗，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。見表6。

3 討論

芪術(shù)鼻噴霧劑處方為玉屏風(fēng)散加減方，具有補益脾肺之氣、扶正氣、固護衛(wèi)表、通竅攝涕之功效。其中，黃芪為君藥，主要發(fā)揮益氣固表之功效，藥理實驗表明黃芪中黃酮類成分具有提高機體免疫功能的功效，因此選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量作為澄清工藝評價指標(biāo)之一。同時，參考相關(guān)文獻(xiàn)，防風(fēng)、鵝不食草等藥材中黃酮類成分也具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用[6-9]，是治療過敏性鼻炎的活性成分，故本研究以總黃酮含量和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的綜合評分作為評價澄清工藝指標(biāo)。

表4 正交試驗結(jié)果

注：Z=(X/Xmax)×60+(Y/Ymax)×40。

表5 方差分析

注：F0.05(1,2)=19，F(xiàn)0.01(1,2)=99。

以總黃酮、毛蕊異黃酮含量為指標(biāo),根據(jù)醇沉的影響因素，并通過直觀分析與方差分析確定了最優(yōu)工藝條件：藥液相對密度為1.05，醇沉濃度為60%，攪拌速度為300r/min。該優(yōu)化工藝經(jīng)重復(fù)試驗驗證，結(jié)果滿意。

表6 正交驗證試驗 (mg·g-1)

[1] 王佩,劉曉昱,吳錫銘，等.蟬貝口服液的澄清工藝研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)報，2009,27(2)：428-430.

[2] 李圓圓，宋英，方芳，等.HPLC測定益心通脈合劑中丹參素鈉和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013,19(22)：64-67.

[3] 房樹標(biāo)，李艷彥，劉必旺，等.紫外分光光度法測定蒙古黃芪中總黃酮的含量[J].中國藥物與臨床，2007,7(12)：899-901.

[4] 畢宏生，郭俊國，解孝鋒，等.正交試驗優(yōu)選梔子的水提醇沉工藝[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014,20(1)：19-23.

[5] 孫學(xué)惠，胡北，馬宏達(dá)，等.正交試驗法優(yōu)選健胃清腸合劑的水提醇沉工藝[J].中國藥師，2013,16(5)：700-702.

[6] 李慶.黃芪的藥理藥效研究進展[J].醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)資訊，2006,3(11)：128-129.

[7] 沈自強.黃芪的現(xiàn)代藥理研究進展[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2011,30(19)：111-112.

[8] 劉宇，楊艷芳，劉紅兵，等.鵝不食草的化學(xué)成分及生物活性研究進展[J].湖北中醫(yī)雜志，2005,27(5)：52-53.

[9] 林遠(yuǎn)燦，高明.鵝不食草的化學(xué)成分及藥理研究進展[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，35(2)：303-304.

(責(zé)任編輯：李嵐春)

Optimization of Clarification Technology for Qizhu Nasal Spray by Orthogonal Test

He Baoying1，Tang Anling1，Wang Congying1，Yang hongmei1，Song Ying2*

(1. Pharmacy college，chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China；2.The Affiliated Hospital of chengdu University of TCM，Chengdu 610072，china)

Objective:To optimize the clarification process of Qizhu nasal spray. Methods:By determining total flavons content,Calycosin separately glycosidase content and clarity to compare four different clarification process.With orthogonal test was adopted,the content of calycosin separately glycosidase and total flavons was used as the indexes to optimize the condition of clarification process.Results:Alcohol deposition method had a better clarification result.Optimum water extraction technology of Qizhu nasal spray was as follows：relative density of water extract 1.05 g·mL-1．Alcohol precipitation concentration 60%，stirring speed 300r·min-1.Conclusion:This optimized clarification process was stable and feasible，which could be extended to industrial production of Qizhu nasal sprays．

Nasal Spray；Clarificationt；Calycosin Separately Glycosidase；Total Flavons

2014-09-19

賀寶瑩(1989-)，女，成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向為中藥新制劑、新劑型、新技術(shù)。E-mail: hebaoying126@126.com

宋英(1959-)，教授，成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院主任藥師，研究方向為中藥新制劑、新劑型、新技術(shù)研究。E-mail: 1046849223@qq.com

R283.69

A

1673-2197(2014)24-0019-03