羽衣甘藍中多酚的提取與抗氧化活性研究

林格西,吳圣遷,江俊妮,王夢嬋,陳 功,藍星宇,李向榮

(浙江大學城市學院 醫學院 藥學系，浙江 杭州 310015)

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羽衣甘藍中多酚的提取與抗氧化活性研究

林格西,吳圣遷,江俊妮,王夢嬋,陳 功,藍星宇,李向榮*

(浙江大學城市學院 醫學院 藥學系，浙江 杭州 310015)

目的：優化羽衣甘藍中多酚成分的提取工藝，確定羽衣甘藍最佳提取條件,研究多酚對三種自由基的清除率，進一步分析羽衣甘藍中多酚的抗氧化活性。方法：多酚提取主要采用超聲波提取方法，并通過正交試驗確定優化提取條件，采用鄰苯三酚自氧化法、Fenton反應、DPPH法檢測其清除自由基。結果：羽衣甘藍優化提取條件為：料液比1∶20,乙醇濃度為50%，提取時間40min，溫度40℃。根據該條件提取總多酚，提取率為6.4mg·g-1，清除自由基能力良好。對多酚總抗氧化活性能力進行研究，其抗氧化特性較好。結論：采用正交實驗優化羽衣甘藍最佳提取條件，提取出的多酚成分對人體自由基清除作用良好，并具有較好的抗氧化活性。

羽衣甘藍；多酚；提取；抗氧化活性

植物多酚具有多種保健功能，其中最重要的是抗氧化功能。藥材羽衣甘藍中多酚成分對活性氧自由基具有較強的捕捉能力，且可對由氧自由基誘發的生物大分子損傷起到保護作用，具有明顯的抗突變、抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老等功能。因此，植物多酚在醫藥、食品、保健品、化妝品等行業具有巨大的應用前景和價值，而羽衣甘藍的抗氧化活性研究未見文獻報道。由羽衣甘藍提取多酚并進行抗氧化活性研究，對天然蔬菜食品和綜合利用農資具有良好的經濟效益[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 羽衣甘藍；無水乙醇：分析純，太倉新太酒精有限公司；無水碳酸鈉(太倉美達試劑有限公司)，分析純；福林酚試劑(上海澤衡生物技術有限公司)；沒食子酸對照品；DPPH(純度98.0%，美國SIGMA公司)；無水乙醇(中國杭州化學試劑有限公司)，純度99.7%；維生素C(中國杭州化學試劑有限公司)，純度99.7%；其它試劑為分析純。

1.1.2 儀器 超聲儀(KQ-700DB型控數超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司)；紫外可見分光光度計7200型(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)，JY6001型；純水儀(MILIPORE凈水系統)；分析天平：梅特勒-托利分析天平(METTLER TOLEDOXS105,d=0.01mg)；真空泵：循環水式多用真空泵SHB-IIIA(河南省太康科教器材廠)；電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9240A型(上海精宏實驗設備有限公司)；恒溫水浴鍋HH4(國華電器有限公司)；PH計：PHS-C3型(上海精密科學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 多酚的提取 稱取一定量羽衣甘藍，洗凈，切成碎片，置于50℃烘箱中烘干，烘干后研磨成粉末狀，并封裝于真空干燥器內備用；稱取0.8g羽衣甘藍粉末，在正交設定條件下采用超聲方法提取，提取液用真空抽濾泵抽濾，低溫保存[2]。

1.2.2 正交實驗 提取條件：乙醇濃度、提取時間、料液比、溫度四個因素，每因素設定三個水平，進行三水平四因素的正交實驗，按L9(34)正交表的實驗設計，提取2次，合并提取液，測定提取液中多酚含量[3]。

表1 正交實驗水平因素

1.2.3 多酚含量測定 ①沒食子酸標準曲線繪制。精密量取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mL質量濃度為0.1mg·mL-1的沒食子酸標準溶液于5mL容量瓶中，加入1mL福林酚試劑，充分震蕩后靜置2～3min；各容量瓶均加入濃度為20% 的Na2CO3溶液2mL,搖勻，加入蒸餾水定容至刻度，置于25℃恒溫水浴鍋反應1h；于波長765nm處測定吸光度值，同時做空白實驗。以沒食子酸質量濃度(X)為橫坐標，吸光度值(Y)為縱坐標繪制標準曲線，并采用二元線性回歸法回歸線性方程。

②總酚含量測定。精密量取1mL羽衣甘藍提取液，分別加入1mL福林酚試劑和2mL Na2CO3溶液，搖勻，加入蒸餾水定容至刻度，置于25℃恒溫水浴鍋中水浴反應1h；于波長765nm處測定吸光度值，同時做空白實驗。測得的吸光度根據標準曲線方程可測得羽衣甘藍中多酚成分的含量。

1.2.4 抗氧化活性的測定 ①對DPPH自由基的清除。稱取2,2-二苯代苦味?；?2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)標準品20mg，無水乙醇定容至500mL，即得質量濃度0.04mg·ml-1溶液。取溶液2mL，加入不同濃度樣品液2mL，室溫反應30min，于517nm波長處測定吸光度，空白組以2mL無水乙醇代替樣品液，測試3組，采用Vc做對照, 計算清除率，公式為[4]：

DPPH 自由基清除率(E) =(1-A樣/A空)×100%

②對羥自由基的清除。 設置三種試管，未損傷管中加入2mL磷酸緩沖液(pH為7.4)和1mL鄰二氮菲(濃度為0.75mmol·L-1),混勻后加入0.75mmol·ml-1硫酸亞鐵溶液1mL，再加入蒸餾水1.5mL。損傷管以1mL濃度為0.01%的過氧化氫溶液代替，樣品管則加入0.5mL溶液，不同濃度樣品液以蒸餾水代替。所有試管均于37℃水浴反應1h，于波長537nm處分別測得吸光度。測試3組，采用Vc做對照，計算清除率，公式為[5]：

清除率= (A樣-A損/A未損-A損)×100%

③對超氧陰離子自由基的清除。 精密量取4.5mL濃度為50mmol·L-1的Tris-HCl緩沖溶液( pH為8.2 )于試管中，加入1mL不同濃度樣品液，于25℃水浴反應20min，加入25℃水浴預熱的3mmol·L-1鄰苯三酚0.3mL，在325nm波長下測定吸光度，且每隔30s測定1次，聯系測定4min，以蒸餾水做空白對照。測試3組，并用Vc作對照，計算羽衣甘藍清除率，公式為[6]：

清除率= (△Ao-△A1/△Ao) ×100%

式中：Ao—空白組吸光度；A1—樣品吸光度。

④總抗氧化能力測定。 在2.5mL磷酸鹽緩沖液(pH為6.6)中加入不同濃度的樣品溶液2.5mL及1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL；混合物在50℃恒溫20min，加入濃度為10%的三氯乙酸溶液2.5mL，取5mL溶液加蒸餾水5mL和0.1%的FeCl3溶液1mL，于700nm處測定吸光度。采用蒸餾水作為無還原能力對照(調儀器零點)，測試3組，以Vc作為對照組。

2 結果

2.1 沒食子酸標準曲線

沒食子酸質量濃度分別為0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03mg·mL-1，吸光度分別為0.362、0.43、0.534、0.601、0.686、0.771。根據測得結果，可繪制沒食子酸的標準曲線，標準方程為：Y=164.57X+0.276，R2=0.997 7。見圖1。

圖1 沒食子酸的標準曲線

2.2 正交實驗結果

以提取溶劑乙醇濃度(體積分數)、料液比、提取溫度、提取時間為考察因素，進行三水平四因素正交實驗，以確定最佳提取條件。結果見表1。

表1 羽衣甘藍多酚提取正交試驗結果

根據實驗數據分析可知，乙醇濃度、溫度、提取時間、料液比均對羽衣甘藍多酚成分提取率造成影響，其優化最佳提取條件為A3B2C2D2，即乙醇濃度為50%，提取時間40min，溫度40℃，料液比為1∶20，可在此優化提取條件提取多酚。最優提取工藝提取羽衣甘藍多酚質量濃度為0.32mg·mL-1，提取率為6.4mg·g-1，其中料液比對多酚的提取影響顯著。

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 羥自由基清除能力 羽衣甘藍對羥自由基的清除能力較抗壞血酸強，隨著多酚濃度的增加呈上升趨勢。見圖2。

圖2 多酚對羥自由基清除能力

2.3.2 超氧陰離子自由基清除能力 采用鄰苯三酚自氧化法測定羽衣甘藍中多酚對超氧陰離子自由基的清除能力。鄰苯三酚在堿性條件下可發生自氧化反應，產生濃度穩定的超氧陰離子自由基與中間物，中間物可與超氧陰離子自由基反應，得到一種具有顏色反應的中間產物，對紫外線具有一定的吸收能力，引起某波長處吸光值的線性積累，從而反映抗氧化劑清除能力的大小。

羽衣甘藍中多酚對超氧陰離子自由基清除能力較抗壞血酸弱，隨多酚濃度的增加呈上升趨勢。實驗結果見圖3。

2.3.3 DPPH自由基清除能力 DPPH屬于有機溶劑中一種穩定的自由基，其結構中含有3個苯環，氮原子有1個孤對電子，呈紫色，于517nm處吸收較強。當自由基清除劑存在時，DPPH單電子被配對會使顏色變淺，在最大吸收波長處吸光度變小，且顏色變淺程度與配對電子數成化學劑量關系，因此可用于檢測自由基的清除能力，從而評價實驗樣品的抗氧化活性。

多酚對DPPH自由基清除能力較Vc不明顯，且隨著多酚質量濃度增加清除能力呈上升趨勢。實驗結果見圖4。

圖4 多酚對DPPH自由基清除能力

2.3.4 總抗氧化能力的測定 羽衣甘藍的總抗氧化能力較Vc不明顯，抗氧化能力較弱，且隨著多酚質量濃度升高能力增強。結果見圖5。

圖5 多酚總抗氧化能力

3 討論

植物多酚來源較為廣泛，且安全無毒，并有一定的營養和保健功效，相關研究一直是國內外研究的熱點。本實驗結果表明羽衣甘藍中多酚成分對DPPH 、超氧陰離子和羥自由基均具有較強的清除效果，且抗氧化能力較好，可為羽衣甘藍進一步應用提供理論依據。羽衣甘藍優化提取條件為：料液比1∶20,乙醇濃度為50%，提取時間40min，溫度40℃。根據該條件提取總多酚，提取率為6.4mg·g-1，清除自由基能力良好。對多酚總抗氧化活性能力進行研究，其抗氧化特性較好。

綜上所述，采用正交實驗優化羽衣甘藍最佳提取條件，提取的多酚成分對人體自由基清除作用良好，并具有良好的抗氧化活性。本實驗初步探討羽衣甘藍多酚的提取工藝與抗氧化活性，關于多酚的分離純化及生物活性有效具體成分尚待進一步研究。

[1] 趙曉云,趙博,邢媛媛,等.荷葉多酚的微波輔助提取工藝優化及其抗氧化活性研究[J].中國釀造,2010(3):79-83.

[2] 樊素芳,王彩霞,徐翠蓮,等.山藥總多酚的提取工藝優化[J].安徽農業科學,2010(33): 18770-18772.

[3] 李燾,屈新運,王喆之.菘藍種子總多酚提取工藝的優化及抗氧化活性研究[J].中成藥, 2011(11): 12.

[4] 劉佳,焦士蓉,唐遠謀,等.苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性[J].食品科學,2011,32(14): 134-138.

[5] 孫瑾,王宗舉,陳崗,等.橄欖中多酚類物質體外抗氧化活性研究[J].中國食品添加劑, 2010(3):69-7.

(責任編輯：李嵐春)

2014-08-27

浙江大學城市學院大學生科研基金(9x2013562114)

林格西，女，浙江大學城市學院在讀生，研究方向為藥學。

李向榮，男，浙江大學城市學院教授，碩士生導師，研究方向為天然產物藥效物質的分離純化及藥效學。E-mail:lixr@zucc.edu.cn

R284.2;TQ461

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1673-2197(2014)24-0014-03