反相高效液相色譜法測(cè)定保嬰鎮(zhèn)驚丸中大黃素和大黃酚含量

鞏長(zhǎng)芹

（山東省臨沂市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,山東 臨沂 276001）

保嬰鎮(zhèn)驚丸收載于部頒標(biāo)準(zhǔn)第八冊(cè),由大黃、甘草、朱砂組方,原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有性狀和檢查項(xiàng)目,而無含量測(cè)定項(xiàng),不能有效地控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。該處方中大黃為主藥,大黃素和大黃酚為大黃的主要活性成分。本研究中選擇測(cè)定大黃藥材中大黃素和大黃酚的含量作為本品質(zhì)控定量指標(biāo),建立了準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、可靠的大黃素和大黃酚的分析方法,能有效控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Agilent1260型高效液相色譜儀（配在線脫氣機(jī)、G1311C四元泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315DDAD檢測(cè)器,美國 Agilent公司）；XS205DU型電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。大黃素對(duì)照品（供含量測(cè)定用,中國藥品生物制品檢定所,批號(hào)為110756-200110）,大黃酚對(duì)照品（供含量測(cè)定用,中國藥品生物制品檢定所,批號(hào)為110796-201017,含量以 99.6%計(jì)）；保嬰鎮(zhèn)驚丸（濟(jì)南宏濟(jì)堂制藥有限責(zé)任公司,批號(hào)為 1012001,1012002,1012003）；甲醇為色譜純,水為純化水,其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18柱（250mm ×4.6mm,5μm）；流動(dòng)相:甲醇-0.1% 磷酸（85∶15）；流速:1.0mL/min；柱溫:35℃；進(jìn)樣量:5μL。大黃素和大黃酚的分離度分別為3.4和9.5,理論板數(shù)分別為14510和18265。

2.2 溶液制備

精密稱取大黃素對(duì)照品 4.12mg、大黃酚對(duì)照品9.10mg,置100mL容量瓶中,加甲醇溶解,并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液。取本品適量,研細(xì),取約1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,置水浴中回流30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,濾過,取續(xù)濾液10 mL,蒸干,加水20mL使溶解,加鹽酸2mL,三氯甲烷20mL,置水浴中回流1 h,取出,放冷,取三氯甲烷液,水液用三氯甲烷提取3次,每次15mL,合并三氯甲烷液,蒸干,用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,過濾,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。按保嬰鎮(zhèn)驚丸處方比例精密稱取全方中除大黃以外的其他藥材,按供試品溶液制備方法制備,即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

干擾試驗(yàn):取對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺大黃的陰性對(duì)照品溶液,按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果,在供試品溶液色譜圖中,分別有與對(duì)照品大黃素、大黃酚保留時(shí)間一致的特征峰,保留時(shí)間分別為6.26,8.44min,陰性對(duì)照品溶液無此特征峰,表明陰性樣品對(duì)所測(cè)組分無干擾,見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:取 2.2 項(xiàng)下的對(duì)照品溶液 1,2,4,6,8,10,12,15μL,按擬訂色譜條件分別自動(dòng)進(jìn)樣,記錄色譜圖。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X,μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得大黃素、大黃酚回歸方程 Y素=2880.116 X-0.1906（r=0.999999）,Y酚=4244.042 X＋2.3637（r=0.999998）。結(jié)果表明,大黃素、大黃酚進(jìn)樣量分別在 0.0412～0.6180μg和 0.09060～1.3890μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液,按擬訂色譜條件自動(dòng)重復(fù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣量5μL,記錄色譜圖。結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積平均值分別為593和1927,RSD分別為0.09%和0.07%(n=6),表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品（批號(hào)為1012002）溶液,室溫下放置,分別于配制后 0,2,4,6,8,10,12,24 h 時(shí)各進(jìn)樣 1 次,進(jìn)樣量5μL,記錄色譜圖。結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積平均值分別為512 和 1257,RSD 分別為 0.11% 和 0.05%(n=8),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):分別精密稱取同一批（批號(hào)為1012002）樣品6份,依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣5μL,記錄大黃素、大黃酚的峰面積。結(jié)果大黃素、大黃酚平均含量分別為0.890mg/g和 1.478mg/g,RSD 分別為 0.18% 和 0.14%(n =6),表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):取已知含量的同一批（批號(hào)為1012002）保嬰鎮(zhèn)驚丸6份,每份0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別精密加入大黃素、大黃酚對(duì)照品溶液10 mL。依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件,分別進(jìn)樣5μL測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1 大黃素、大黃酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品,依法制備供試品溶液,按擬訂色譜條件,分別進(jìn)樣5μL,記錄大黃素、大黃酚峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果批號(hào)為1012001,1012002,1012003的樣品中大黃素和大黃酚的含量分別為 0.912,0.890,0.899mg/g 和 1.489,1.478,1.502mg/g。

3 討論

保嬰鎮(zhèn)驚丸具有清熱、鎮(zhèn)驚、導(dǎo)滯的功效,主治小兒急熱驚風(fēng)、實(shí)熱目赤、口瘡、便燥、小便赤黃。大黃具有瀉熱毒、破積滯、行瘀血之功效,治實(shí)熱便秘、譫語發(fā)托、食積痞滿、痢疾初起、里急后重等癥,為方中君藥。為了用藥安全,必須控制其質(zhì)量,建立其標(biāo)準(zhǔn)。

蒽醌類成分在254 nm波長(zhǎng)處有最大吸收[1-5],故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇254 nm。參考2010年版《中國藥典（一部）》中大黃藥材含量測(cè)定的流動(dòng)相[1-3],結(jié)果以甲醇-0.1% 磷酸溶液（85∶15）為流動(dòng)相,各成分峰形好,分離度高,陰性無干擾。且此方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,為保嬰鎮(zhèn)驚丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了科學(xué)依據(jù)。

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