痛經(jīng)寧顆粒微生物限度檢查方法的驗(yàn)證

洪 亮

（浙江省臺州市食品藥品檢驗(yàn)所,浙江 臺州 318000）

痛經(jīng)寧主要由當(dāng)歸（酒炒）、香附（醋制）、白芍（炒）、丹參、延胡索（醋制）、川楝子（炒）、川芎（炒）、炙甘草、紅花等組方,具有調(diào)經(jīng)止痛的功效[1]。當(dāng)歸、香附、白芍、丹參、川芎等藥所含有效成分或提取物中,單個或多個組分對細(xì)菌及霉菌均有一定的抑制作用。根據(jù)其用途、成分和制法,按2010年版《中國藥典（一部）》微生物限度檢查法[2],在對具有抗菌活性的藥物進(jìn)行微生物限度檢查時,應(yīng)首先消除其抗菌活性,并對所用方法進(jìn)行驗(yàn)證,以確定是否適用[3]。

1 儀器、材料與試藥

萬級空氣凈化間、百級凈化臺、生物安全柜（杭州金利凈化工程有限公司）；LDZX-50FBS型電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；電子天平（常熟雙杰測試儀器廠）；DAG-9248A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,GNP-9270型恒溫培養(yǎng)箱,霉菌培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；80-2型離心沉淀器（上海手術(shù)器械廠）。大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌 [CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌 [CMCC（B）63501]、白色念珠菌 [CMCC（F）98001]、黑曲霉 [CMCC（F）98003],均由浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院提供。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號為130129）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號為 1201062）、改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基（批號為 120913）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號為120614）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號為1212152）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號為120306）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG,批號為101020）,均購自北京三藥科技開發(fā)公司。pH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（青島藍(lán)雁綠檢生物技術(shù)有限公司,批號為20130521）,0.9%無菌氯化鈉溶液（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號為130118）。痛經(jīng)寧顆粒（浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司,批號分別為 D13130101,D13130102,D13130103,規(guī)格為每包12 g,生產(chǎn)日期為2013年1月24日）

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液與供試液的制備

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,在30～35℃下培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,在23～28℃下培養(yǎng)24～48 h后,將上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液；接種黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5～7 d,加入3～5 mL含0.05% （mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi),用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)50～100 cfu的孢子懸液[2]。稱取樣品10 g至滅菌錐形瓶中,加入溫度約為45℃、pH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL,不斷振蕩混勻,制成1∶10的供試液。

2.2 細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法的驗(yàn)證

2.2.1 平皿法和培養(yǎng)基稀釋法

試驗(yàn)組:1）平皿法。取1∶10供試液,分別注入直徑為90mm的平皿中,每個平皿注入 1mL,并分別加入試驗(yàn)菌 1mL（50～100 cfu/mL）,分別傾注相應(yīng)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15 mL。按大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌順序平行制備,每種菌制備2個平皿,以下同。2）培養(yǎng)基稀釋法。取1∶10供試液1mL,等量分注于5個平皿中,每個平皿中再分別加入試驗(yàn)菌1mL（50～100 cfu/mL）,立即傾注相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基 15 mL。以上制備的平皿分別置 30～35℃下培養(yǎng) 3 d和23～28℃下培養(yǎng)5 d,按平皿法測定其菌數(shù)。

菌液組:分別取上述稀釋的試驗(yàn)菌液1mL注入平皿內(nèi),再傾注相應(yīng)培養(yǎng)基。每種試驗(yàn)菌平行制備2個平皿,測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

供試品對照組:取1∶10供試液1mL和0.2mL,按照試驗(yàn)組方法操作,不加菌液,測定供試品的本底菌數(shù)。

稀釋劑對照組:用 PH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品,加入試驗(yàn)菌,按照試驗(yàn)組方法操作。

結(jié)果:見表1。可見,平皿法3次試驗(yàn)5種菌株均不同程度受到了抑制；培養(yǎng)基稀釋法3次試驗(yàn),大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率均超過70%,白色念珠菌、黑曲霉菌則達(dá)不到回收率要求,說明此方法對細(xì)菌計數(shù)有效,須重新建立霉菌和酵母菌計數(shù)方法的驗(yàn)證。

2.2.2 薄膜過濾法

1∶10供試液為混懸液,取上液按每膜10mL進(jìn)行過濾,濾過效率很低,未溶解顆粒堵塞濾孔。而文獻(xiàn)[4]和2010年版《中國藥典(一部)》表明,采用 500 r/min的速率離心 3 min,對霉菌的回收率影響較大,不宜采用離心法。因此選用每膜1 mL,1∶10供試液進(jìn)行過濾。

表1 平皿法和培養(yǎng)基稀釋法試驗(yàn)結(jié)果(%)

試驗(yàn)組:取 1∶10供試液 1 mL加入含 50 mL pH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的滅菌濾器中進(jìn)行薄膜過濾。接著用pH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進(jìn)行沖洗,每膜每次沖洗50mL,振搖濾過,分別嘗試用每膜200,300,400mL的沖洗量進(jìn)行沖洗。在最后1次沖洗中,每膜加入試驗(yàn)菌1mL（50～100 cfu/mL）,過濾。取出濾膜,菌面朝上,貼于已制備好的玫瑰紅鈉瓊脂平皿里,平行制備2個平皿。置23～28℃下培養(yǎng)5 d,逐日觀察,按平皿法測定其菌數(shù)。

菌液組:分別取稀釋好的白色念球菌、黑曲霉菌2種菌液各1 mL注入平皿內(nèi),再傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。每種試驗(yàn)菌平行制備2個平皿,測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

供試品對照組:取1∶10供試液1mL,按照試驗(yàn)組方法操作,不加菌液,測定供試品的本底菌數(shù)。

稀釋劑對照組:用pH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1mL替代供試品,加入試驗(yàn)菌,按照試驗(yàn)組方法操作。

結(jié)果:見表2。可見,取3次平行試驗(yàn)稀釋劑對照組和試驗(yàn)組的菌回收率均在70%以上的最簡方法為痛經(jīng)寧顆粒的菌落計數(shù)法。綜合表1和表2,可得出細(xì)菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法,霉菌和酵母菌計數(shù)采用薄膜過濾法（1∶10供試液1mL/膜＋300 mL/膜沖洗量）。

2.3 控制菌檢查法的驗(yàn)證[5]

2.3.1 培養(yǎng)基稀釋法

試驗(yàn)組取3批樣品的1∶10供試液各10mL及10～100 cfu/mL大腸埃希菌菌液1mL加入滅菌錐形瓶中,再分別嘗試加入300,400,500 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基,于35℃下培養(yǎng)24 h,依大腸埃希菌檢查法項(xiàng)下方法進(jìn)行檢查。

2.3.2 控制菌驗(yàn)證結(jié)果

由表3可見,在3批樣品的平行試驗(yàn)中,采用培養(yǎng)基稀釋法（加400 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基）為最優(yōu)方法,試驗(yàn)組檢出大腸埃希菌,可按此方法進(jìn)行痛經(jīng)寧顆粒的控制菌檢查。

表3 大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4 微生物限度檢查驗(yàn)證結(jié)果

綜合以上驗(yàn)證結(jié)果,通過5種試驗(yàn)菌、3次平行試驗(yàn)的回收率方法學(xué)驗(yàn)證及控制菌方法驗(yàn)證,得出痛經(jīng)寧顆粒的微生物限度檢查法:細(xì)菌計數(shù)采用培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.2mL）,霉菌和酵母菌計數(shù)采用薄膜過濾法（1∶10供試液1mL/膜＋300mL/膜沖洗量）,控制菌檢查采用培養(yǎng)基稀釋法（加400mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基）。

3 討論

痛經(jīng)寧顆粒在水中溶解后為混懸液,故在制備1∶10供試液時,需將稀釋液加熱至45℃再稀釋或放在45℃恒溫振蕩儀中振搖溶解；同理,在采用薄膜過濾法時,應(yīng)考慮是否進(jìn)行低速離心,去除不溶于稀釋劑中的藥物顆粒。而文獻(xiàn)[4]和2010年版《中國藥典(一部)》表明,采用 500 r/min的速率離心 3 min,對細(xì)菌的回收率影響較小,但對霉菌和酵母菌的回收率影響很大,因此,霉菌和酵母菌計數(shù)不宜采用低速離心沉淀法。又因10mL,1∶10供試液很難進(jìn)行薄膜過濾,未溶于水的藥品顆粒會堵塞濾孔,故考慮用每膜1mL,1∶10供試液來進(jìn)行薄膜過濾。

驗(yàn)證計數(shù)方法時,由于樣品在水中的溶解性一般,1∶10供試液為混懸液,并對細(xì)菌和霉菌均有一定的抑制作用,因此首先嘗試常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法。根據(jù)上述2種方法對各試驗(yàn)菌的回收結(jié)果,選擇各試驗(yàn)菌回收率在70%以上的方法作為有效方法。

使用薄膜過濾法,沖洗量要適當(dāng),由表2可見,沖洗量越多,則薄膜上的微生物損傷越嚴(yán)重,且過大的沖洗量容易使薄膜破損,導(dǎo)致假陰性結(jié)果出現(xiàn)。在沖洗過程中,對沖洗液的溫度應(yīng)進(jìn)行控制,應(yīng)在40～45℃為宜。過低的溫度容易使藥物析出,堵塞或吸附在薄膜上；過高的溫度容易傷害樣品中的污染菌,導(dǎo)致假陰性。每次沖洗時,還應(yīng)振搖濾器,使吸附在薄膜中的藥物更容易被洗脫除去。

除去供試品抑菌作用的方法有培養(yǎng)基稀釋法、低速離心沉淀法、薄膜過濾法等,或幾法聯(lián)用[3]。本品中的幾味中藥材都具有一定的抑菌活性,驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果也表明,供試品對試驗(yàn)菌種均有抑菌作用,因此采用培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果各規(guī)定菌種的回收率均達(dá)到《中國藥典》要求[6]。本方法用于痛經(jīng)寧顆粒的質(zhì)量控制有效、可行。

參考文獻(xiàn):

[1]WS-10812（ZD-0812）-2002.國家食品藥品監(jiān)督管理局·國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編[S].

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄ⅩⅢC.

[3]蘇德模,馬緒榮.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京:華齡出版社,2007:218.

[4]袁林娜,宋 勤.微生物限度檢查法中低速離心法回收細(xì)菌、真菌試驗(yàn)方法的研究[J].藥物分析雜志,2007,27（10）:1620-1622.

[5]中國藥品生物制品檢定所,中國藥品檢驗(yàn)總所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:351.

[6]黃 英.清熱安宮丸等中成藥微生物限度檢查方法驗(yàn)證[J].中國藥業(yè),2013,22（24）:38-40.