動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定阿奇霉素中細(xì)菌內(nèi)毒素含量

張 娟,祝清芬,范治云,魏 霞,史國(guó)生

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東 濟(jì)南 250101）

阿奇霉素為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素,與紅霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制有共同點(diǎn),屬抑菌性抗生素,對(duì)酸穩(wěn)定,半衰期長(zhǎng)[1],有較高的生物利用度。它可通過(guò)與細(xì)菌核糖核蛋白體的50 s亞單位結(jié)合妨礙肽鏈的延長(zhǎng),影響細(xì)菌蛋白合成而達(dá)到抑菌作用。其應(yīng)用方便、療程短、療效肯定,具備理想抗生素的條件,對(duì)青霉素過(guò)敏及兒科患者更有實(shí)際意義[2]。其臨床用于治療各種敏感性細(xì)菌引起的上呼吸道感染、泌尿道感染和皮膚軟組織感染[3-5]。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是控制藥物注射劑重要的安全性指標(biāo)[6]。阿奇霉素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)）中規(guī)定了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng),限值規(guī)定應(yīng)小于0.2 EU/mg。在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn),某些樣品由于pH等原因,對(duì)凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有明顯的干擾作用。本試驗(yàn)中參照2010年版《中國(guó)藥典（二部）》[7]細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法中的動(dòng)態(tài)濁度法,對(duì)阿奇霉素中的細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)進(jìn)行了研究,以尋求一種快速、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)方法。

1 儀器與試藥

BET-48G型細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀（天大天發(fā)科技有限公司）；ZH-2型自動(dòng)漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠(chǎng)）；試驗(yàn)用試管、刻度吸管等玻璃器材按規(guī)定清洗,250℃干烤1 h除去外源性?xún)?nèi)毒素。阿奇霉素原料（煙臺(tái)只楚藥業(yè)有限公司,批號(hào)分別為1205004,1205005,1205006）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)為150601-201174,規(guī)格為每支160 EU）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET用水,湛江安度斯生物有限公司,批號(hào)為1209030,規(guī)格為每支5 mL）；動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司,批號(hào)為1301212,可測(cè)內(nèi)毒素范圍0.01～10EU/mL,規(guī)格為 1.25 mL,有效期至2015年12月）。

2 方法與結(jié)果[7-9]

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立和可靠性分析

設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)各點(diǎn)濃度為 2.0,0.5,0.125,0.03125 EU/mL。用BET用水稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品,使其最終濃度分別為2.0,0.5,0.125,0.03125 EU/mL,各取 0.1 mL,分別加至預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi),混合均勻,插入BET-48G型細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)濃度重復(fù)3管,同時(shí)做陰性對(duì)照（NC）。以平均反應(yīng)時(shí)間的對(duì)數(shù)（lg T）為縱坐標(biāo)、內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)（lg C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得回歸方程lg T=-0.2369 lg C＋2.8123,r=-0.9989（絕對(duì)值應(yīng)大于 0.980）,平行管之間的 RSD 均小于10%,陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最低濃度的反應(yīng)時(shí)間,細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)成立。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及可靠性分析結(jié)果（n=3）

2.2 供試品制備及最小有效稀釋質(zhì)量濃度的確定

阿奇霉素在水中幾乎不溶,在甲醇、丙酮、三氯甲烷、無(wú)水乙醇或稀鹽酸中易溶。先采用0.05 mol/L稀鹽酸溶解供試品,制得25 g/L的供試品溶液,用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) PH至中性。本品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）為 0.2 EU/mg,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最低濃度（λ1）為 0.03125 EU/mL,供試品的 MVD = CL/λ1=160 倍,及最小有效稀釋質(zhì)量濃度為0.15625 g/L。

2.3 干擾試驗(yàn)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)內(nèi)毒素濃度的設(shè)置,選擇0.25EU/mL作為 λm。選擇批號(hào)為1205004的阿奇霉素,用0.05 mol/L稀鹽酸溶解供試品,制得25 g/L的供試品溶液,用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性。用BET用水進(jìn)行稀釋,使其終質(zhì)量濃度分別為2.5,1.25,0.625,0.3125,0.15625 g/L,作為供試品溶液（A 液）,同時(shí)制備含上述供試品質(zhì)量濃度并含內(nèi)毒素濃度為 λm（0.25EU/mL）的溶液（B液）。分別取上述各液0.1 mL,加至預(yù)先加有 0.1 mL鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi),混合均勻,插入儀器內(nèi)測(cè)定,每個(gè)濃度重復(fù)2管。測(cè)定結(jié)束后,按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程分別計(jì)算出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 λm的供試品溶液的內(nèi)毒素含量,并計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率（R）。結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 供試品干擾試驗(yàn)及供試品細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定結(jié)果（n=2）

由表 2可見(jiàn),2.5 g/L及以下質(zhì)量濃度時(shí),回收率均在50%～200%,符合要求,因此建議采用2.5 g/L及以下質(zhì)量濃度進(jìn)行試驗(yàn)。另取批號(hào)為1205005和1205006的兩批樣品,分別制備2.5 g/L供試品稀釋液（A液）和濃度相同的供試品且含內(nèi)毒素濃度 λm（0.25 EU/mL）的溶液（B 液）,依法檢查。結(jié)果見(jiàn)表 2,B液回收率均在50%～200%,符合要求。

3 討論

在2010年版《中國(guó)藥典（二部）》中,阿奇霉素口服制劑有明確的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,而對(duì)注射劑目前還沒(méi)有相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則中規(guī)定,靜脈用注射劑均應(yīng)設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素（或熱原）檢查項(xiàng)。為此,本研究中運(yùn)用動(dòng)態(tài)濁度法對(duì)阿奇霉素進(jìn)行干擾試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量的測(cè)定。阿奇霉素在水中幾乎不溶解,根據(jù)其對(duì)酸穩(wěn)定的性質(zhì),本研究中采用0.05mol/L稀鹽酸將其溶解,并將pH調(diào)至中性后,進(jìn)行干擾試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查,解決了其溶解性的問(wèn)題。

由阿奇霉素的干擾試驗(yàn)結(jié)果顯示,阿奇霉素可用細(xì)菌內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行檢測(cè),樣品質(zhì)量濃度為2.5 g/L時(shí),細(xì)菌內(nèi)毒素回收率在50%～200%內(nèi),即對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾,且3批樣品的內(nèi)毒素含量均在規(guī)定限值0.2 EU/mg以下。

動(dòng)態(tài)濁度法能直觀(guān)地反映樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量,檢測(cè)過(guò)程及結(jié)果處理完全通過(guò)儀器執(zhí)行,具有快速、大范圍定量的特性,使干擾試驗(yàn)在1～2次試驗(yàn)后完成,節(jié)約成本,克服了凝膠法檢驗(yàn)結(jié)果只能判斷產(chǎn)品的內(nèi)毒素含量是否超標(biāo),而無(wú)法給出準(zhǔn)確的含量的不足,避免了熱原法由于家兔差異及人為主觀(guān)判斷所出現(xiàn)的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[10-11]。運(yùn)用動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定阿奇霉素中細(xì)菌內(nèi)毒素較以往用凝膠法具有更低的檢測(cè)下限,可較準(zhǔn)確地反應(yīng)樣品中內(nèi)毒素的含量,值得推廣。

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