漢桃葉總黃酮的提取及其鎮痛抗炎活性研究

黃 婧 ,馬健雄

（1.廣西壯族自治區桂林市第二人民醫院藥劑科,廣西 桂林 541001； 2.廣西醫科大學,廣西 南寧 530021；3.廣西金海堂藥業有限責任公司新藥研發中心,廣西 南寧 530313）

漢桃葉,又名七加皮,為五加科植物廣西鵝掌藤 Schefflera arboricola Hayata的干燥莖枝或帶葉莖枝,性味微苦、溫,為廣西特色藥材,具有祛風活絡、消腫止痛等功效[1]。在壯族醫藥中,常用于治療類風濕關節炎等疾病。漢桃葉有鎮痛、抗炎、抗菌等作用[2],但其鎮痛抗炎活性物質并未明確。為此,筆者系統研究了漢桃葉黃酮類化合物的提取工藝,并對其鎮痛、抗炎作用進行了測試,為漢桃葉的深度開發提供參考。

1 儀器與材料

旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；TV-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京醫療設備廠有限責任公司）；EL204型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。漢桃葉采自廣西南寧市郊,并經廣西中醫藥研究院劉步鳴教授鑒定為正品；蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所,批號為0770-200804）；二甲苯（北京長海化工廠,批號為20080530）；醋酸（天津市泰興化工有限公司,批號為20091203）；延胡索乙素（中國藥品生物制品檢定所,批號為110726-200409）；地塞米松（長春長紅制藥廠,批號為20100419）；伊文思藍（國藥集團化學試劑有限公司,批號為20090913）；其他試劑均為分析純。昆明種小鼠,由廣西醫科大學實驗動物中心提供,SPF級,證書號為SCXK桂2009-0002。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含量測定

方法選擇:采用分光光度法,以蘆丁為對照品測定漢桃葉醇提物總黃酮含量。

標準曲線繪制:參照文獻[3],采用分光光度法,以蘆丁為對照品測定并繪制質量濃度（C）對吸光度（A）的標準曲線,測定值經最小二乘法進行線性回歸,分析得蘆丁對照品的回歸方程為A= 1.0527C ＋ 0.0059（r= 0.9999）。

樣品測定:稱取漢桃葉粗粉適量,按正交試驗設計得到的最佳工藝條件進行提取,過濾后濾液轉至100mL容量瓶,加乙醇定容至100 mL,即得待測樣品溶液。精確吸取該溶液2mL,稀釋至10mL,再吸取5 mL置試管中,參照文獻[3]的方法,以空白試劑作對照,于510 nm波長處測定吸光度,根據蘆丁標準曲線,計算樣品中總黃酮含量。

2.2 黃酮提取工藝優化(正交試驗)

通過預試驗得知,影響漢桃葉黃酮類物質含量提取效果的主要因素有乙醇濃度（因素A）、提取時間（因素B）、提取次數（因素C）和固液比（D）,故以漢桃葉總黃酮含量為評價指標,按照 L9（34）進行正交試驗設計,因素水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表

按照表1中的因素水平進行正交設計試驗,結果見表2和表3。可見,影響黃酮得率的因素主次為乙醇濃度 ＞提取時間 ＞固液比 ＞提取次數,以極差最小的C因素作為誤差項進行方差分析,表明A因素有顯著性差異,故提取的最佳條件為 A2B3C2D2。在此條件下,經平行檢驗5次,得黃酮平均提取率為20.09mg/g,進一步驗證了正交試驗結果的準確性。

表2 黃硐提取工藝 L9(34)正交試驗結果

表3 方差結果分析表

2.3 活性測試試驗[4-5]

藥液制備:用正交設計試驗得出的最佳工藝對漢桃葉藥材進行提取,得總黃酮浸膏加適量蒸餾水制成濃度為0.2 g/mL的藥液,備用。

鎮痛試驗:取小鼠50只,雌雄各半,稱重標記后隨機分為生理鹽水組（NS,A組）、延胡索乙素組(B組)和漢桃葉高、中、低劑量組(C1,C2,C3組),每組 10 只,灌胃給藥,每日 1 次,連續給藥 7 d。末次給藥30min后,向各鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2mL（用前配制）。觀察并記錄注射醋酸溶液后20 min內出現扭體反應次數及時間以評價藥物的鎮痛作用。結果見表4,B組和C1組與A組比較有顯著性差異（P＜0.01）,C1組鎮痛效果與B組相當。

表4 漢桃葉黃酮鎮痛試驗結果（±s,n=10）

表4 漢桃葉黃酮鎮痛試驗結果（±s,n=10）

P 抑制率（%）組別A組B組C 1組C 2組C 3組給藥量20 mL/k g 50 m g/k g 50 g/k g 30 g/k g 10 g/k g扭體次數27.5±2.36.9±2.77.6±2.79.2±2.112.8±2.174.9172.3666.5453.45＜0.01＜0.01＜0.05

二甲苯致小鼠耳腫脹試驗:取昆明種小鼠50只,雌雄各半,隨機分為空白對照組(A組),地塞米松組(B組),漢桃葉高、中、低劑量組(C1,C2,C3組),每組 10只。每只小鼠灌胃給藥每日 1次,連續給藥7 d,于末次給藥時,分別將每只小鼠左耳外側均勻涂抹二甲苯0.05mL,右耳不涂二甲苯,4 h后脫頸處死,用直徑8mm的打孔器在同一部位取下耳片,稱取質量,用左右耳片質量差值來表示腫脹程度。試驗結果見表5。與A組相比,C1組小鼠耳廓腫脹程度顯著降低（P＜0.05）,C3組也有一定的降低；在較高劑量時,漢桃葉黃酮與地塞米松抗炎作用相當。

表5 漢桃葉黃酮對二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗結果(±s,n=10)

表5 漢桃葉黃酮對二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗結果(±s,n=10)

組別A組B組C 1組C 2組C 3組給藥量抑制率（%）P 20 m g/k g 50 g/k g 30 g/k g 10 g/k g腫脹度（m g/g）19.16±1.337.56±3.178.29±1.1810.04±1.1312.12±2.1860.5456.7347.6036.74＜0.05＜0.05

3 討論

本研究結果顯示,漢桃葉黃酮類物質最佳提取工藝為藥材粗粉加8倍量80%乙醇回流提取2次,每次1.5 h。本研究中所制備的黃酮在試驗濃度范圍內有較強的鎮痛、抗炎作用,提示漢桃葉黃酮類物質可能為該藥材鎮痛、抗炎的活性物質。本研究結果對于漢桃葉藥材在抗風濕、類風濕的新藥研發其有重要的參考意義。

參考文獻:

[1]廣西壯族自治區革命委員會衛生局.廣西本草選編（下冊）[M].南寧:廣西人民出版社,1974:1720.

[2]陳 蕾,朱霧虹,林瑞超.鵝掌柴屬植物化學成分及生理活性研究概況[J].中藥材,2002,25（5）:363-366.

[3]丁利君,吳振輝.金銀花中黃酮類物質最佳提取工藝的研究[J].食品科學,2002,23（2）:62-66.

[4]陳 奇.中藥藥理實驗方法[M].北京:人民衛生出版社,l991:107-108.

[5]秦貽強,李 江,蔡小玲.紅魚眼醇提物鎮痛抗炎作用的實驗研究[J].中國藥房,2011,22（43）:4046-4048.