熒光定量PCR檢測HBV—DNA與ELISA方法測定乙肝血清標志物相關性分析

【摘要】 目的 用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測乙型肝炎患者血清中HBV-DNA的含量，了解其與酶聯免疫吸附方法（ELISA）測定乙肝血清學標志物（乙肝兩對半）的關系。方法 采用RT-PCR方法和ELISA方法，分別檢測141例乙型肝炎患者血清中HBV-DNA含量和乙肝兩對半指標。根據血清學標志物：乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒表面抗體（HBsAb）、乙肝病毒e抗原（HBeAg）、乙肝病毒e抗體（HBeAb）、乙肝病毒核心抗體（HBcAb）結果的不同模式，將141例患者分組。結果 發現HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性組患者血清中存在高水平HBV-DNA，陽性率達98.1%（51/52）；HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性組患者血清中HBV-DNA水平稍低，陽性率達80.8%（42/52）；HBsAg、HBcAb陽性組患者血清中HBV-DNA水平陽性率也達到了82.4%（28/34）。結論 ELISA法檢測乙肝兩對半能提供乙肝感染的間接證據，而RT-PCR法檢測HBV-DNA準確靈敏，能真實反映HBV感染、復制及病程變化，在乙肝診斷、治療及藥效評價方面有應用價值。

【關鍵詞】 實時熒光定量PCR技術；HBV-DNA；乙肝血清學標志物

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.04.036

文章編號：1004-7484（2014）-04-1836-01

隨著對乙型肝炎病毒（HBV）分子生物學研究的深入，以及實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT—PCR）方法的普遍開展，目前對乙型肝炎血清學標志物的臨床意義已有了新的認識。本文選取撫順市中心醫院分子生物學實驗室2013年間的141例乙肝患者HBV-DNA檢測結果，根據其血清學標志物不同模式將其分組進行比較，現將分析結果總結如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 為本院2013年1月至2013年11月住院及門診的經臨床確診的乙型肝炎患者141例，男性87例.平均年齡46歲；女性54例，平均年齡44歲。

1.2 HBV血清學標志物 檢測采用常規酶聯免疫吸附測定（ELISA）方法，ELISA試劑盒購自（上海科華生物工程實業有限公司），操作嚴格按說明書進行。

1.3 儀器設備 Rotor-GeneQ實時熒光定量PCR分析儀（德國凱杰）。HBV-DNA提取和擴增試劑盒來自凱杰生物技術有限公司。

1.4 RT-PCR檢測 HBV-DNA方法采用煮沸裂解法，從血清中提取HBV—DNA。同時做陰性、臨界陽性、強陽性質控品。4個標準品均由試劑盒配置，HBV-DNA濃度依次為104lU/ml、105lU/ml、106lU/ml和107lU/ml。按下列條件進行擴增，93℃2min，然后按93℃45s-55℃60s10個環，93℃30s-55℃45s30個循環。反應結果由儀器自動分析得出血清標本的乙肝病毒量。該儀器檢測靈敏度為5×102lU/ml，大于該濃度為陽性結果。

1.5 定量結果統計方法 將各組HBV-DNA定量結果分組統計，分為>106lU/ml組、103-106lU/ml組、<103lU/ml組和陰性組。計算各組樣本比例數。

2 結 果

141例血清標本根據血清學標志物：乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒表面抗體（HBsAb）、乙肝病毒e抗原（HBeAg）、乙肝病毒e抗體（HBeAb）、乙肝病毒核心抗體（HBcAb）結果的不同模式分組，其HBV-DNA檢測結果見表1。

3 討 論

結果發現第一組HBsAg、HBeAg、HBcAb陽性組患者血清中存在高水平HBV-DNA，陽性率達98.1%（51/52）；第二組HBsAg、HBeAb、HBcAb陽性組患者血清中HBV-DNA水平稍低，陽性率達80.8%（42/52）；HBsAg、HBcAb陽性組患者血清中HBV—DNA水平陽性率也達到了82.4%（28/34）。但各個組中HBV-DNA定量水平分布情況存在很大差別。第-組94.2%的患者HBV-DNA定量在106lU/ml以上，提示HBeAg與HBV-DNA的存在是完全-致的，二者具有相似的流行病學意義[1]。如此高的病毒載量，證明了乙肝兩對半呈大三陽模式的乙肝患者具有很強的傳染性。

HBcAb過去-直被認為對乙肝病毒感染有保護作用，是預后良好的征象。本研究中第二組患者血清中HBV-DNA陽性率達80.8%，說明HBeAb的出現仍有病毒的復制。但HBV-DNA定量集中在103-106lU/ml，說明隨著HBeAg轉陰，病毒復制減少。有資料認為，這種情況的復制是免疫清除不全和乙肝病毒毒株變異所致，多發生在慢性肝炎[2]。第三組HBV-DNA陽性率與第二組相似，但HBV-DNA定量結果比第二組低，目前認為是處于乙肝病毒感染恢復期或基因突變[3]。單項HBcAb陽性提示機體既往感染或急性感染的“窗口期”，出現這種模式時應作RT-PCR進行病毒定量加以區分。以上分析表明，血清乙肝兩對半陽性者，無論何種組合模式均存在病毒復制的可能[4]。

在技術上，RT-PCR采用熒光標記和閉管檢測，克服了常規PCR擴增產物污染所致假陽性的缺點，使結果具有極高的特異性和敏感性[5]。但在分析RT-PCR結果時，還應考慮以下因素：①RT-PCR的反應體系復雜，易受多種因素影響。待測標本的溶血、脂血、處理不當都會導致其假陽性或假陰性；②RT-PCR只能檢測血中游離的HBV-DNA，當病毒整合到肝細胞染色體上，隨同肝細胞一起復制、表達時，ELISA可出現陽性反應，但血清中已沒有HBV顆粒存在，此時RT-PCR可為陰性；③當患者感染的HBV-DNA發生突變，不能與熒光探針結合，RT-PCR為陰性，而ELISA可為陽性。ELISA法檢測乙肝兩對半的影響因素也較多，只能反映機體對乙肝病毒的免疫反應狀態，不能直接反映血清中的病毒含量。當患者處于恢復期或既往感染，ELlSA檢測乙肝兩對半可有多種模式，是否有乙肝需做RT-PCR進行病毒定量。因此，在乙肝病毒感染的診斷上，二者有各自的優點，不可互相替代。兩者相互結合，能為臨床診斷、治療方案的選擇及療效觀察提供更可靠的依據。

參考文獻

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