湖南省常德地區雞致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

摘要：從湖南省常德地區的3個不同雞場采集105份病料，通過細菌分離和生化鑒定共分離得到75株雞源性大腸桿菌，其中60株為致病性大腸桿菌。對分離得到的75株雞大腸桿菌進行30種抗生素的敏感性試驗表明，分離菌株對30種抗菌藥物均有不同程度的耐藥性，且多重耐藥現象普遍；在30種受試藥物中，高敏的藥物分別為頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢唑啉、頭孢噻肟、丁胺卡那霉素等6種。

關鍵詞：雞；致病性大腸桿菌；耐藥性

中圖分類號： S852.61+2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0226-03

收稿日期：2013-10-10

基金項目：湖南省“十二五”重點建設學科（動物學）項目（編號：湘教發[2011]76 號）；湖南省高校科技創新團隊項目（編號：2008244）；湖南省動物學重點實驗室項目（編號：200824632）；湖南文理學院青年專項基金（編號：QNYX0811）。

作者簡介：李娜（1977—），女，吉林長春人，碩士，講師，研究方向為預防獸醫學。E-mail：vetlina@163.com。大腸桿菌為臨床上常見的病原菌，在腹瀉畜禽的糞便中及各種原因引起的敗血癥畜禽中都能分離到致病性大腸桿菌。該病的主要特征包括心包炎、肝周炎、臍炎、氣囊炎、敗血癥、眼炎、滑膜炎、卵黃性腹膜炎等，多繼發新城疫、傳染性喉氣管炎等疾病，導致雞群高死亡率，對養雞生產的危害極大[1]。國內已有很多關于雞大腸桿菌病流行病學的研究報道，主要針對我國的主要省（市），而對較小的市、縣的研究報道并不多。由于大腸桿菌血清型多、抗原復雜，在小區域間也存在較大差異；同時隨著抗生素的廣泛應用，大腸桿菌的耐藥性越來越強。為了能準確防治雞大腸桿菌病，應在盡可能小的區域內對其進行病原血清型調查，并合理用藥。目前，國內尚無對湖南省常德地區雞場大腸桿菌耐藥性監測的調查研究報道。為此，筆者從2006年10月至2012年12月對湖南省常德地區范圍內的雞大腸桿菌病流行情況和耐藥情況進行了調查和監測，以了解湖南省常德地區的主要流行菌株的耐藥規律，為獸醫臨床用藥提供指導性參考意見。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1病料采集在2006年10月至2012年12月期間，選取105份湖南省常德地區飼養的疑似大腸桿菌病雞的臟器。

1.1.2培養基及試劑普通瓊脂平板培養基、三糖鐵（TSI）瓊脂培養基、伊紅美蘭（EMB）瓊脂培養基、麥康凱（MAC）瓊脂培養基，購自北京奧博星生物技術責任有限公司；生化試驗微量發酵管，購自杭州微生物試劑有限公司；普通營養肉湯，自制。

1.1.3試驗動物18～25 g/只的小白鼠，購自湖南農業大學小動物室。

1.1.4藥敏紙片試驗用藥敏紙片共30種，包括阿莫西林、哌拉西林、氧氟沙星、環丙沙星、諾氟沙星、氨芐青霉素、苯唑青霉素、妥布霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素、鏈霉素、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢氨芐、四環素、氯霉素、紅霉素、新霉素、壯觀霉素、強力霉素、林可霉素、乙酰螺旋霉素、氯潔霉素、呋喃妥因、氨曲南、復方新諾明、利福平等，購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1細菌形態與分離培養將采集的新鮮病料分別劃線接種于普通培養基、MAC、EMB培養基上，同時分別穿刺TSI瓊脂管，置于37 ℃恒溫箱培養18～24 h后觀察；挑取疑似的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，將培養特性及形態、染色反應、排列均符合大腸桿菌特征的菌株劃線接種于普通營養瓊脂平板上進行細菌的數次純化，然后將純化的細菌接種于普通斜面培養基上，4 ℃保存備用。

1.2.2生化特性鑒定將分離的60個致病菌株接種于普通肉湯中，37 ℃恒溫箱培養24～48 h后適量接種于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、棉子糖、尿素、H2S、靛基質、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、MR、VP微量發酵管中，置于37 ℃恒溫箱培養24 h后觀察生化反應結果。靛基質發酵管中滴加1滴靛基質試劑、MR發酵管中滴加1滴MR試劑即可觀察結果；VP發酵管中滴加2滴VP甲液、1滴VP乙液，置于37 ℃培養2 h即可觀察結果。

1.2.3大腸桿菌致病性試驗取已鑒定的、生化反應符合大腸桿菌的各個菌株于37 ℃恒溫箱培養18 h的普通肉湯培養物（菌液濃度為3.0×109 CFU/mL），經純粹檢驗合格后分別腹腔接種18～25 g小白鼠，按0.2 mL/只的劑量接種，每個菌株接種6只；對照組按相同的途徑接種0.2 mL普通肉湯培養液，共接種6只。接種后飼養觀察120 h小白鼠的存活情況，記錄小白鼠的死亡時間并對死亡小白鼠進行剖檢取肝臟、心臟，用EMB平板進行接種菌回收試驗以分離致病菌。

1.2.4分離菌藥物敏感性試驗采用WHO推薦的 Kriby-Bauer （K-B）法[2]對分離鑒定的75株大腸桿菌進行耐藥性監測，判斷標準參照美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）頒布的M100-S15藥敏試驗紙片擴散法法規[2]和相關文獻[3-4]，以高敏、中敏、低敏或耐藥3種形式對抑菌圈大小作出判定。先將菌株接種到普通營養瓊脂斜面培養基上，37 ℃ 恒溫箱培養18 h，用生理鹽水洗下菌苔；將菌懸液稀釋到麥氏比濁管中，相當于終濃度5×107～1×108 CFU/mL；將普通營養瓊脂傾注于直徑為10 cm的平皿上，制成厚4 mm的營養瓊脂平板，15 min內用滅菌棉拭子蘸取上述濃度的菌懸液，在管內壁擠去多余菌液后在瓊脂平板表面涂布接種3次，每次旋轉70°，最后沿平板內緣涂抹1周；室溫干燥3～5 min后，用無菌鑷子將藥敏紙片緊貼于營養瓊脂平板表面，各紙片中心的距離應大于24 mm，紙片距平板內緣的距離應大于 15 mm；37 ℃恒溫箱培養16～18 h后觀察結果，記錄各紙片的抑菌圈直徑。

2結果與分析

2.1細菌形態及生長情況

由細菌培養結果可知，在普通營養瓊脂平板上的菌落生長良好、濕潤，呈現半透明狀態與灰白色，邊緣光滑；在EMB瓊脂培養基平板上的細菌形成中等大小、邊緣整齊、表面光滑、黑紫色帶金屬光澤的菌落；在MAC瓊脂培養基平板上的細菌長出圓形粉紅色、表面光滑圓形中等大小的菌落；TSI管底及斜面培養的細菌均變黃色，產氣而不產硫化氫；經過革蘭氏染色鏡檢后，鏡下均可見大量散在的紅色、中等大小、兩端鈍圓的無芽孢G-短小直桿菌。

2.2分離菌的生化特性

分別對分離出的60株致病細菌進行生化試驗，結果均符合大腸桿菌的生化特性，詳見表1。

2.3大腸桿菌致病性試驗

小白鼠在接種分離菌12 h后，均表現出精神不振，18 h后開始出現死亡，48 h后全部死亡；而對照組小白鼠健康活潑。剖檢死亡的小白鼠可見肝臟腫大瘀血，表面散在針尖大小的出血點，心包膜、腹膜、肺、腎、脾臟均有不同程度的出血。從死亡小白鼠的肝臟、心臟中均可分離到分離菌。綜合試驗結果可知，分離菌株的培養特性、形態、染色反應均符合大腸桿菌特性，確定為致病性大腸桿菌。

2.4分離菌藥物敏感性試驗結果

以抑菌圈直徑大小作為判定藥物敏感性高低的標準，抑菌圈直徑越大表明細菌對該藥的敏感性越高。抑菌圈直徑≥21 mm為高度敏感；在15.1～20.0 mm范圍內為中度敏感；≤14 mm 為低敏或耐藥。抑菌圈直徑的測定結果見表2。研究表明，雖然常德地區3個不同養雞場的大腸桿菌菌株對30種藥物的敏感性存在一定差異，但是同一養雞場的大腸桿菌菌株對抗生素的敏感性幾乎一致。

養殖戶把藥物防治作為控制大腸桿菌的主要手段，但藥敏試驗普及率很低，用藥盲目性非常大，且在實際生產中有時用藥不合理，如低劑量長時間使用，隨意加大劑量或根據個人經驗感覺盲目添加等，均會造成大腸桿菌嚴重耐藥，從而導致藥效下降甚至無效，藥物控制難度增大，耐藥菌株增多。75 株受試大腸桿菌均對除頭孢曲松外的29種抗菌藥物有多重耐藥性，表現為對4種或4種以上藥物耐藥，8耐菌株所占比例最大，為14.67%；其次是5耐、9耐，分別占10.67%、9.33%。因此在臨床用藥方面或作為飼料添加藥物時，有條件的應該進行藥敏試驗，盡量選擇高效敏感的藥物，盡量避免長期大量使用同一種藥物，也可以幾種藥物交替使用，要足量、按療程給藥，以免產生耐藥性。

參考文獻：

[1]劉觀忠，趙超，董修建.“痢得停”對蛋用雛雞大腸桿菌病的治療效果及作用機理研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2012（11）：145-147.

[2]Wayne P A. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[M]. Pennsylvania：NCCLS，2001：1-23.

[3]李剛，文英，鐵生虎，等. 規模化豬場仔豬致病性大腸埃希菌的耐藥性檢測[J]. 動物醫學進展，2010，31（8）：117-121.

[4]Khan A，Das S C，Ramamurthy T，et al. Antibiotic resistance，virulence gene，and molecular profiles of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from diverse sources in Calcutta，India[J]. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（6）：2009-2015.