阿勒泰羊與新疆細毛羊ASIP基因多態性與被毛顏色的相關性

摘要：利用PCR-SSCP方法檢測了阿勒泰羊和新疆細毛羊ASIP基因的多態性位點，并分析各 SNPs 位點與被毛毛色之間的關系。結果表明，阿勒泰羊ASIP基因外顯子2（g.100～104 bp）存在 5 堿基丟失（D5：AGGAA），外顯子4（g.5172 bp：T→A）存在非同義性突變（Ser→Cys）；新疆細毛羊中只發現ASIP基因外顯子 2（g.100～104 bp）存在 5 堿基丟失（D5：AGGAA）；阿勒泰羊ASIP基因2處SNPs與被毛毛色不相關（P>0.05），而新疆細毛羊ASIP基因5堿基丟失與被毛毛色極顯著相關（P<0.01）。

關鍵詞：新疆細毛羊；阿勒泰羊；ASIP基因；SNPs；毛色；PCR-SSCP

中圖分類號： S813.8；S826.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0042-04

收稿日期：2013-10-14

基金項目：國家“863”計劃（編號：2011AA100307-06）；國家科技支撐計劃（編號：2011BAD28B05-1）；國家自然科學基金（編號：31001002、31360540）。

作者簡介：孟浩浩（1988—），男，江蘇豐縣人，碩士研究生，主要從事綿羊毛色相關基因的篩選與鑒定研究。E-mail：576270343@qq.com。

通信作者：代蓉，副研究員，主要從事綿羊育種及養羊技術推廣等工作。Tel：（0993）6683760；E-mail：dairong1@163.com。哺乳動物體內的色素分布廣泛、種類多樣，大量研究表明，黑色素細胞產生的酪氨酸源性色素（真黑素、褐黑素）是影響皮毛顏色的主要因素[1]。褐黑素為溶于堿的圓形紅色顆粒，使皮膚、毛發表現為黃色、紅色；真黑素比褐黑素難溶解，使皮膚和毛發表現為黑色、褐色[2]。動物表皮和毛囊中真黑色素、褐黑素的相對表達量最終決定了動物毛色。

ASIP是影響綿羊毛色的主要候選基因，在色素形成中起重要的調控作用[3]。它與α-促黑色素細胞激素（α-MSH）競爭結合黑素皮質激素受體1（melanocortin-1，MC1R），使MC1R結構改變，抑制環磷酸腺苷（cAMP）酶系統，引起cAMP 水平下降，通過級聯反應，促進褐黑素的產生[4-5]。ASIP基因在綿羊基因組中存在多個拷貝和等位基因[6]，編碼的鼠灰信號蛋白由133個氨基酸殘基組成。在研究藏羊、哈爾達綿羊等品種時發現，ASIP基因與綿羊的毛色相關。人、馬、牛、羊駝、兔、狗等物種ASIP基因多態性位點與毛色和膚色之間關系的研究已有大量報道，研究發現突變位點與毛色相關，但目前尚未深入探討細毛羊該基因與毛色形成的關系。因為細毛羊經長期選育均為白色個體，由于生物多樣性和種質特性的關系，其他綿羊、山羊的研究結果并不能完全反映新疆細毛羊中該基因的特點。筆者長期從事優質細毛羊的選育研究，在實際生產中發現了自然突變的黑色細毛羊個體，這為開展ASIP基因與細毛羊毛色形成的關系提供了極好的試驗樣本。本研究以新疆細毛羊及阿勒泰羊為模型，探究 ASIP 基因SNPs 位點與綿羊毛色的關系，以期為探明綿羊毛色形成的調控機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1樣本采集及 DNA 提取

采集新疆農墾科學院試驗羊場成年阿勒泰羊（黃色、白色各 1 只，黑色 11 只，棕色 96 只）及新疆細毛羊（棕色5只，白色60只）耳緣組織（圖1），利用酚-氯仿法提取組織DNA，經瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測的合格樣品放于-20 ℃保存備用。

1.2主要試劑

蛋白酶K、無水乙醇、Tris-飽和酚、氯仿、常規PCR試劑（TaKaRa），瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺（Sigma公司），DL 100 bp Marker（天根 Code：DM109），變性加樣緩沖液[甲酰胺98%、10 mmol/L EDTA（pH值 8.0）、 0.25%溴酚藍、 0.25%二甲苯青]、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根 Code：DP209）。

1.3引物設計

根據GenBank 數據庫中綿羊 ASIP基因（Genbank 登錄號：EU420022）設計引物（表 1），這3對引物分別位于ASIP基因的外顯子 2、3、4上，引物由 Invitrogen 公司合成。

1.4ASIP基因核苷酸多態性分析

2.4ASIP各基因型頻率與基因頻率

從表3、表4可知，本研究中檢測到阿勒泰羊、新疆細毛羊外顯子2有2種基因型（N5N5、N5D5），在阿勒泰羊中N5N5基因型頻率較高，而新疆細毛羊中結果恰好相反。經卡方檢驗發現，該基因型與阿勒泰羊毛色不存在相關性（P>0.05），但與新疆細毛羊毛色顯著相關（P<0.01）。外顯子4中檢測到2種基因型（AB、BB），經卡方檢驗發現，該位點基因型與2種綿羊的毛色不相關（P>0.05）。

3結論與討論

阿勒泰羊毛色以棕紅色或淡棕色為主，純黑、純白、純黃的阿勒泰羊不多[7]；新疆細毛羊以白色為主，黑色或其他毛色的新疆細毛羊稀少。在本研究樣品中，棕色阿勒泰羊和白色新疆細毛羊占多數，純黑、純白、純黃的阿勒泰羊及棕色細毛羊個體數較少。為使研究結果更為直觀，本研究沒有采集頭部、四肢與身體毛色相異的阿勒泰羊組織樣。

ASIP是影響綿羊毛色的主要候選基因，在綿羊基因組中存在多個拷貝和等位基因[6]。ASIP 編碼的鼠灰信號蛋白由133個氨基酸殘基組成，在不同品種綿羊中 SNPs 位點存在差異：藏羊的ASIP基因外顯子 2 只存在 5 bp（g.100～104 bp：AGGAG）的丟失[8]；澳大利亞美利奴綿羊[6]、哈薩克羊[9]外顯子 2 既存在 5 bp（g.100～104 bp：AGGAG）丟失，又存在 9 bp（g.10～19 bp：AGCCGCCTC）丟失。研究表明，美利奴羊的顯性白色受 ASIP基因、AHCY 編碼區及 ITCH 啟動子區域的影響，多拷貝的ASIP基因編碼區受臨近的多個ITCH啟動子調控，導致顯性白色表型[6]；有關藏羊毛色與ASIP基因拷貝數的研究表明，藏羊純白與純黑表型與ASIP基因拷貝數不相關[8]。本研究結果與以往對藏羊[8]、美利奴羊[6]、哈薩克羊[9]的研究結果一致：ASIP基因外顯子 3中沒有發現 SNPs位點。阿勒泰羊ASIP基因外顯子 2 存在 5 bp（g.100～104 bp：AGGAG）丟失，這與已往研究結果相同。但在供試阿勒泰羊、新疆細毛羊樣品中沒有發現該品種綿羊存在 9 bp丟失，可能是由于部分毛色表型的羊個體數較少，致使其沒有被檢測到，可通過擴大樣品量再篩查。

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