正交設計優化油松ISSR—PCR反應體系

摘要：采用正交設計的方法對油松ISSR-PCR反應體系5因素（Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的濃度）在4水平上進行優化試驗，PCR結果用SPSS數據軟件分析。結果表明：各因素不同水平對PCR反應結果都有顯著的影響，且除dNTP因素外其他4因素影響均較大；篩選出各反應因素的最佳水平，建立油松ISSR-PCR的最佳反應體系（20 μL）為：Taq DNA聚合酶1 U、模板5 μg/μL、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、引物0.4 μmol/L；進行梯度退火試驗，篩選出針對不同引物的最適的油松ISSR退火溫度。該優化體系的建立為油松及其近緣種的系統學和種質資源鑒定及遺傳多樣性的研究奠定基礎。

關鍵詞：油松；分子標記；ISSR-PCR；反應體系；正交設計

中圖分類號： S722.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0046-04

收稿日期：2013-11-01

基金項目：河北省自然科學基金（編號：C2008000231）；河北農業大學科研基金（編號：QJ201230）。

作者簡介：王樹香（1977—），女，河北唐山人，碩士，實驗師，主要從事微生物學、分子生態學研究。Tel：（0312）7528256；E-mail：wangshuxiang77@163.com。

通信作者：高寶嘉，博士，教授，主要從事生態學、森林有害生物管理研究。E-mail：baojiagao@163.com。油松（Pinus tabulaeformis）為我國特有樹種，是我國溫帶針葉林中主要的建群樹種，在工業用材、城鎮綠化和荒山造林中具有重要的價值。就目前研究的相關資料來看，國內關于油松的遺傳多樣性和遺傳結構的研究較多。如李毳等利用RAPD、ISSR（inter simple sequence repeat，簡單重復序列區間）等分子標記方法對天然油松群體作了遺傳多樣性分析[1-4]；郝真真等從表觀上對ISSR-PCR進行了優化，并研究了油松種群遺傳多樣性和空間遺傳結構特征[5]。ISSR分子標記技術具有多態性水平高、可重復性好、DNA用量少、成本低等優點，廣泛用于群體遺傳多樣性分析和種質鑒別等研究[6-13]。但是，采用正交設計的方法對油松ISSR-PCR反應體系進行優化還無報道，因此，本試驗利用正交設計從Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模板DNA、Mg2+等5個因素4個水平進行分析，優化并建立油松ISSR-PCR反應體系，從而提高ISSR分析結果的可靠性和重復性，為油松品種的分子鑒定、遺傳多樣性分析和品種改良奠定試驗基礎。

1材料與方法

1.1材料

油松選于河北省遼河源國家級森林公園（北緯41°00′～41°10′、東經118°30′～118°40′），采集當年生針葉置于冰盒中帶回實驗室，置于-70 ℃超低溫冰箱中保存備用。試驗用Taq DNA聚合酶、dNTP購自上海寶生科技發展有限公司，引物（USB811）由上海寶生科技發展有限公司合成。

1.2基因組DNA提取和PCR擴增

采用UNIQ-10 柱式新型植物基因組DNA抽提試劑盒[購自生工生物工程（上海）股份有限公司]從油松葉片中提取多株植物基因組總DNA，提取的DNA作為ISSR-PCR反應體系的模板。所提DNA樣品的純度和含量用紫外吸收和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3PCR反應因素的確定與正交表的設計

為了確定PCR反應中5個因素（Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物）的最佳反應濃度，采用正交設計L16（45）于4個水平上進行試驗，每個處理重復2次，每個處理體積均為20 μL（表1），其中加入2.0 μL無Mg2+的10×Buffer，其他成分按照正交設計所分析的濃度加入，不足 20 μL 的用超純水補足。16個處理在美國ABI 2720型PCR儀上進行擴增，反應程序初步定為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃再延伸7 min；4 ℃保溫。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠在 3 V/cm 電壓下電泳，電泳結果采用BIO-RAD Doc-2000自動凝膠成像系統成像，并用SPSS 18.0軟件進行方差分析，進而獲得油松ISSR-PCR最佳反應條件。

1.4退火溫度梯度檢測

在正交試驗結果分析的基礎上，利用擴增儀進行PCR反應程序中退火溫度梯度試驗，退火溫度設置為46～55 ℃，擴增儀自動生成46.0、49.0、52.0、55.0 ℃等4個溫度梯度。所用的PCR擴增體系為正交設計所得出的最佳體系。

2結果與分析

2.1電泳結果評分

正交試驗PCR產物電泳結果見圖1，獲得的16個處理的譜帶結果存在很大差異。參照何正文等的方法[14]，依據譜帶強弱和雜帶的多少對PCR擴增結果依次打分。其中，條帶數量多、清晰的擴增結果計16分，最差的計1分。2次重復分別獨立統計，16個處理的分數見表1。

2.2各因素對ISSR-PCR反應影響的差異分析

將上述處理和評分結果用SPSS數據處理軟件進行方差分析，結果見表2。由F值可知，模版DNA的濃度對反應結果的影響最大，dNTPs濃度的影響最小，各因素水平變化對PCR反應的影響從大到小依次為模板DNA的濃度、Taq DNA聚合酶的濃度、引物的濃度、Mg2+的濃度、dNTPs的濃度。由于各因素水平間的差異除dNTPs和Mg2+的濃度外均達到了顯著水平，可以進一步進行因素內水平間的多重比較（表3）。

試驗中模板DNA對反應體系影響顯著，這與白錦軍等的研究結果[15]相似，但與吳根土等的研究結果[16-17]相反，其原因可能是因為模板DNA中含有酚、多糖等雜質，會抑制Taq DNA聚合酶活性，從而影響結果，因此說明高質量的基因組DNA是獲得穩定ISSR-PCR結果的前提。在油松的 ISSR-PCR 反應體系中，Taq DNA聚合酶、Mg2+和引物的濃度對PCR擴增結果影響顯著，這與前人的研究結果[18-19]相同。本試驗結果顯示dNTPs的濃度變化對PCR結果影響不顯著，這不同于其他研究結果[20-21]，分析其原因可能是單因素梯度試驗結果的分析未考慮其他因素的交叉影響，造成不可避免的試驗誤差，而本試驗采用正交試驗方差分析，從而提高了分析結果的可靠性。

本試驗構建的油松ISSR-PCR最佳反應體系中，除模板DNA濃度偏高外，Taq DNA聚合酶量、Mg2+濃度、引物濃度、dNTPs濃度均與其他親緣相近樹種相似，如紅松[22]、云南松[23]等。ISSR反應對某些物種模板DNA濃度不太敏感，但本研究結果顯示影響是極顯著的，也與賀佳等的研究結果[24]相同。退火溫度在減少模板與引物間的非特異性結合，進而提高PCR反應的特異性方面具有重要作用，因此本試驗對篩選出的14條引物逐個進行退火溫度梯度試驗，確定每個引物的最適退火溫度，為以后相似研究提供參考。本試驗優化的穩定ISSR反應體系可以為油松品種選育奠定基礎，同時對油松種質資源鑒定、親緣關系分析、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建等領域提供科學依據。

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