天府黑兔卵巢中卵泡發育的組織學研究

摘要：為了探索天府黑兔卵巢中不同發育階段卵泡的組織定量結構，采用連續石蠟切片技術，對4只天府黑兔母兔的卵巢進行組織切片，在光學顯微鏡下觀察，并利用組織形態測量軟件測量不同發育階段卵泡的直徑、卵母細胞的直徑和透明帶厚度。結果表明：原始卵泡的直徑為（40.23±0.27） μm，其卵母細胞的直徑為（23.86±2.23） μm；初級卵泡的直徑為（56.26±6.72） μm，其卵母細胞直徑為（31.03±1.33） μm；次級卵泡的直徑為（18132±17.12） μm，其卵母細胞直徑為（81.35±3.14） μm；三級卵泡的直徑為（750.69±32.69） μm，其卵母細胞直徑為（106.21±4.34） μm。卵泡直徑（x）和卵母細胞直徑（y）在發育過程中的回歸關系是y=2.297x0.643（r2=0.88）。

關鍵詞：兔；卵泡發育；組織學；直徑

中圖分類號： S829.13 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0204-03

收稿日期：2014-02-24

基金項目：四川省教育廳科研項目（編號：11ZA146）。

作者簡介：張誼（1976—），男，四川仁壽人，碩士，副教授，主要從事動物遺傳育種與繁殖工作。E-mail：zhangyis707@163.com。隨著現代繁殖技術的發展，一些先進的繁殖技術，如人工授精技術[1]、同期發情技術[2]、兔卵母細胞體外受精[3-4]及其胚胎移植技術[5]等逐步應用于兔的繁殖過程，使其能夠進行快速改良以提高生產性能，極大推動了養兔業的發展。為了進一步發展兔的繁殖生物技術，有必要對兔卵巢中卵泡的生長發育和卵母細胞發育進行組織學研究，探討兔卵泡發育和閉鎖規律，為最大限度地利用兔卵巢上卵泡的潛能奠定基礎。

目前，正常生理條件下兔卵巢組織學定量研究較少，虞斌等用組織學方法對兔卵巢組織移植后進行了研究[6]；毛冠平等研究了孕馬血清促性腺激素（PMSG）對兔進行超數排卵處理后的卵巢組織學結構[7]；張金友等在研究兔超數排卵效果時，也對各種不同劑量單位PMSG、人絨毛膜促性腺激素（hCG）處理的兔卵巢進行了組織學研究[8]；常蘭等對高原兔的卵巢進行了組織結構觀察[9]。

天府黑兔是四川農業大學歷時十余年培育的中型肉兔新品種。該兔全身毛色烏黑發亮、頭短粗、眼黑色、耳直立、體軀寬深、后軀發達；成年體質量4～5 kg，窩產仔數8～12只，生長速度快，適應性強。自然生理狀態下，天府黑兔卵巢卵泡發育方面的組織學研究尚未見報道。本研究通過組織切片與組織定量分析技術對其卵巢中卵泡和卵母細胞發育進行組織學測量，并分析卵泡發育和卵母細胞形態之間的關系，這對天府黑兔卵巢組織定量的深入研究以及充分利用其卵巢上卵母細胞的相關繁殖生物技術的應用具有理論和實踐意義。

1材料與方法

1.1材料

4～5月齡天府黑兔4只，取自四川農業大學教學科研兔場，采用單籠飼養、自由飲水、自然光照。

1.2卵巢收集

兔麻醉后頸動脈放血處死，剖開腹腔取出卵巢，用0.9%生理鹽水沖洗后放入10%中性福爾馬林溶液中固定48 h，將卵巢皮質修剪成15 mm×15 mm×5 mm的薄塊后，再次在10%中性福爾馬林溶液中固定48～72 h。

1.3石蠟切片的制作

卵巢在10%中性福爾馬林溶液中固定后，用全自動組織脫水機（Lecia，TP-8，German）在乙醇梯度溶液（70%、80%、90%、95%、99%、100%）中脫水，透蠟，石蠟包埋后用切片機（Lecia RM235，German）進行連續切片，切片厚度6 μm[10]，然后經展片、脫蠟后，進行HE染色、脫水，二甲苯透明，樹脂（C7901，Sigma，USA）封片。

1.4卵泡的分類

根據Hafes[11]對卵泡分類標準，將卵泡依直徑大小、透明帶的形成、卵泡腔的出現分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡。成熟卵泡通常發生排卵，在卵巢組織切片中呈空泡狀。

1.5組織切片觀察與測定

切到卵母細胞核的切片稱為中緯切片。用顯微鏡（Nikon，90i，Japan）獲取圖像，用ACT-2U生物圖像分析軟件（Nikon Laboratory Imaging Inc.，Japan）測量中緯切片上的卵泡、卵母細胞直徑和透明帶厚度。

1.6統計分析

測量的數據以“平均值±標準差”表示，并用SAS8.1e統計分析軟件采用Pearson分析卵泡直徑、卵母細胞直徑和透明帶厚度之間的相關性，建立卵泡直徑與卵母細胞直徑、透明帶厚度之間的回歸關系。

2結果與分析

2.1卵巢的組織學結構

兔的卵巢組織結構包括生殖上皮、白膜（Al）、皮質（Co）和髓質（Me）。卵巢表面被覆扁平或立方的生殖上皮細胞，生殖上皮下為致密的結締組織構成的白膜（圖1-A）。皮質部在卵巢的外周，染色較深，含有不同發育階段的卵泡、閉鎖卵泡、基質和血管。皮質中原始卵泡（PrF）、初級卵泡（PF）分布于皮質淺層。原始卵泡分布于皮質的外周，單個或三五成群聚集存在，數量較多。初級卵泡分布于皮質的外圍，單個散在或2～3個集中分布，數量較多；次級卵泡（SF）多分布于皮質深層，數量少；三級卵泡突出于皮質表層，數量極少。髓質位于皮質深層，髓質含較多的彈性纖維，其中有許多較大的血管、淋巴管及神經（圖1-B）。

2.2卵泡形態特征

原始卵泡呈圓形或卵圓形，由1個大而圓的卵母細胞和外包的1層扁平卵泡細胞構成，分布在卵母細胞周圍。卵母細胞呈球形，HE染色胞質呈粉紅色，胞核大而圓，位于卵母細胞中央，核仁明顯（圖1-C）。初級卵泡的體積比原始卵泡大，卵泡細胞發育為柱狀或立方狀細胞，并增至多層；當卵母細胞被2～3層立方卵母細胞包圍時，卵泡細胞和卵母細胞之間出現薄層透明帶，HE染色呈淡紅色（圖1-D）；初級卵泡因卵泡細胞的層數變化較大以及卵母細胞的增長，其直徑大小差異較大。次級卵泡卵母細胞增大，顆粒細胞層數增多，透明帶增厚，卵泡膜增厚且內外層清晰；當顆粒細胞增至4～5層時，顆粒細胞排列疏松，靠近卵母細胞的顆粒細胞緊密地包圍著卵母細胞，卵母細胞與顆粒細胞間形成完整的透明帶，同時顆粒細胞間出現大小不等的卵泡腔，卵泡腔里充滿卵泡液（圖1-E）。三級卵泡的卵母細胞進一步增大，隨著卵泡腔的融合增大和卵泡液的增多，卵泡的直徑急劇增大，卵母細胞位于卵泡的一側，與周圍緊密排列的顆粒細胞一起形成卵丘，靠近透明帶的顆粒細胞形成典型的放射冠結構，卵泡膜分化為內外2層（圖1-F）。試驗中未觀察到完整結構的成熟卵泡，只見排卵后的巨大卵泡腔，泡腔直徑在1 000 μm以上。

2.3卵泡直徑、卵母細胞直徑和透明帶厚度

不同發育階段卵泡直徑、卵母細胞直徑、透明帶厚度見表1。卵泡發育過程中，卵泡直徑（原始卵泡28.97～55.26 μm，初級卵泡45.69～87.56 μm）、卵母細胞直徑（原始卵泡1523～37.16 μm，初級卵泡25.17～49.08 μm）、透明帶厚度（次級卵泡3.07～6.16 μm，三級卵泡5.29～9.13 μm）在卵泡生長發育過程中都有明顯的重疊，這說明卵泡的生長發育是一個動態的連續過程。

3討論與結論

3.1兔卵泡發育的組織學特征

兔的原始卵泡是由1個初級卵母細胞和單層扁平的卵泡細胞組成，在原始卵泡和初級卵泡中沒有觀察看到2個或2個以上卵母細胞的現象，這與豬等多胎家畜和大熊貓[12]、雙峰駝[13]、羊駝[14]有很大的差異，而與白唇鹿、東北梅花鹿[15]相似。在大熊貓、雙峰駝中能看到1個卵泡中有多個初級卵母細胞的現象，在對羊駝卵巢卵泡系統進行研究時，觀察到1個卵泡中有4個卵母細胞的現象。單卵泡多卵母細胞的現象可能存在種屬特異性。

3.2透明帶的形成

透明帶是由卵母細胞及顆粒細胞共同分泌某些物質形成的，其主要成分是黏多糖。兔的透明帶是在卵母細胞外包圍2～3層卵泡細胞的初級卵泡中開始出現，出現時間較早，這與牦牛[16]、水牛[17]相似，與川金絲猴[18]、大熊貓[12]、小熊貓[19]、東北梅花鹿[15]等不同（表3）。兔透明帶出現的時期晚于川金絲猴、大熊貓、小熊貓，早于東北梅花鹿，因此，透明帶出現早晚有種屬特異性。

表3部分動物透明帶形成時期

動物透明帶形成時期兔卵母細胞外包有2～3層卵泡細胞的初級卵泡形成透明帶川金絲猴卵母細胞外包有1層矮柱狀卵泡細胞時出現透明帶[18]大熊貓卵母細胞外包有1層矮柱狀卵泡細胞時出現透明帶[12]小熊貓卵母細胞外包有1層矮柱狀卵泡細胞時出現透明帶[19]東北梅花鹿卵母細胞外包有3～4層卵母細胞時出現透明帶[15]牦牛卵母細胞外包有2～3 層卵泡細胞時出現透明帶[16]水牛卵母細胞外包有2～3層卵泡細胞時出現透明帶[17]

3.3卵母細胞發育和卵泡生長的關系

在卵泡發育過程中，卵泡直徑與卵母細胞直徑之間呈顯著相關，其研究結果與高立云等在牛卵泡發育中的研究結果類似[20]，表明在活體或收集的卵巢采卵過程中，可以通過卵泡直徑來獲得發育形態正常的卵母細胞。卵泡生長（x）與卵母細胞（y）的生長呈冪指數關系，可用方程y=2.296 5x0.642 9（r2=0.884 0）表示，這個結果與Lintern-Moore等[21]所得到的卵泡生長（x）與卵母細胞（y）的生長呈直線關系（y=a+bx）和Kaur等[22]所得到的卵泡生長（x）與卵母細胞（y）的生長呈對數關系（lgy=a+blgx）不同，這說明卵泡生長與卵母細胞的生長的回歸關系有著種屬特異性。

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