蛇莓RAPD與ISSR—PCR反應體系優化

摘要：采用單因素試驗結合正交試驗，對PCR反應體系中的5種主要反應因子Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA濃度進行優化篩選，確立了適合蛇莓基因組DNA的RAPD和ISSR反應體系，RAPD反應體系（20 μL）：Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250 μmol/L、Taq酶1 U、引物0.2 μmol/L、DNA模板60 ng；ISSR反應體系（20 μL）：Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 250 μmol/L、Taq酶0.5 U、引物1 μmol/L、DNA模板60 ng。利用確立的體系對24份蛇莓種質進行擴增，結果條帶清晰明亮，多態性好。

關鍵詞：蛇莓；RAPD-PCR；ISSR-PCR；單因素；正交設計；體系優化

中圖分類號： S567.201 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0050-04

收稿日期：2013-11-06

基金項目：湖南省教育廳項目（編號：10C1029）。

作者簡介：張聰子（1987—），男，湖北咸寧人，碩士研究生，從事中藥資源研究。

通信作者：童巧珍，博士，副教授，碩士研究生導師，從事中藥質量與資源研究。E-mail：qztong88@126.com。 蛇莓[Duchesnea indica（Andr.）Focke]為薔薇科蛇莓屬植物，為民間常用草藥，具有清熱解毒、消腫散瘀，收斂止血、涼血之功效[1-2]。長期以來，科研工作者對蛇莓開展了大量研究，近年來，因發現蛇莓具有抗腫瘤活性而更加引起學者們的關注，蛇莓已成為一種開發前途廣闊的植物資源。目前，對蛇莓的研究主要集中在栽培及藥理等領域，分子方面的研究相對較少。本試驗以蛇莓為研究對象，選擇對PCR擴增體系穩定性影響較大的5個因素，包括模板DNA、Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物濃度進行優化，以期確立穩定適合于蛇莓的 ISSR 及RAPD分子標記的PCR反應體系，為蛇莓的資源鑒定與遺傳多樣性研究提供技術依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1蛇莓種質材料取自湖南中醫藥大學藥植園人工栽培的蛇莓新鮮幼嫩葉片，24組樣本均保存于-70 ℃冰箱中。1-24號分別為邵陽隆回1號、邵陽隆回2號、邵陽隆回3號、邵陽隆回4號、邵東、常德1號、常德2號、常德澧縣、大圍山1號、大圍山2號、平江冬塔、平江幕阜山、平江石漿、平江石漿阜西、衡山、永順西岐、瀏陽周洛、株洲、婁底、長沙植物園、長沙市含浦1號、長沙市含浦2號、長沙望城、長沙縣。

1.1.2試劑所用試劑均購于北京鼎國生物公司。RAPD-PCR體系優化選用隨機引物P8，序列為5′-：TCTGGTGAGG-3′；ISSR-PCR體系優化選用引物GRD205 824，序列為 5′-（TC）8A-3′。

1.2基因組DNA提取

蛇莓植物基因組DNA采用試劑盒（北京天根）提取，用核酸蛋白測定儀和l%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。將DNA稀釋成20 ng/μL，貯存于-20 ℃冰箱備用。

1.3PCR擴增及凝膠電泳

ISSR擴增程序[3]為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃再延伸 10 min，4 ℃保存。

RAPD擴增程序[4]為94 ℃預變性5min；94 ℃變性 1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，40個循環；72 ℃再延伸 5 min，4 ℃保存。

PCR產物均用含有溴化乙錠的1.0%瓊脂糖凝膠在 0.5×TBE 中電泳，點樣10 μL，電壓4 V/cm，電泳結束后在凝膠成像系統上檢測拍照。

1.4PCR反應體系的優化

針對20 μL反應體系中的5個主要因素Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA濃度，設定4個水平，分別建立單因素及正交設計表（表1、表2），確立RAPD和 ISSR-PCR 反應體系。

1.5退火溫度的優化

以上述反應體系優化確定的5個因素的最佳濃度水平為基礎，對退火溫度進行優化。將RAPD退火溫度范圍設置為30～45 ℃，由梯度PCR儀隨機生成12個梯度，分別為30.0、303、31.5、33.0、34.8、36.6、38.4、40.2、42.0、43.5、44.6、45.0℃。

ISSR退火溫度設置為45.0～61.5 ℃，由梯度PCR儀隨機生成12個退火溫度。分別為45.0、45.2、46.1、47.5、49.3、514、53.6、55.8、57.8、59.6、60.8、61.5℃。

1.6ISSR-PCR和RAPD-PCR反應體系的驗證

利用上述已建立的ISSR及RAPD反應體系，用RAPD隨機引物P99：5′-GTCCTGGGTT-3′和ISSR引物GRD205835：5′-（TG）8G-3′，對24份蛇莓材料DNA進行PCR擴增，對已確立的RAPD和ISSR反應體系進行驗證。

2結果與分析

2.1單因素試驗

3討論

當前，僅有姚旭麗等采用單因素試驗對蛇莓ISSR-PCR反應體系的主要反應因子進行了優化[5]，但尚未開展ISSR和RAPD分子標記對蛇莓種質資源的研究，由于該方法并沒有考察因素間的相互作用，物種不同反應體系條件也有較大的變化[6]。本試驗選擇單因素結合正交試驗設計對影響蛇莓RAPD和ISSR反應體系的各個因子進行優化，期望得到最佳的PCR反應體系。

PCR對模板DNA濃度、TaqDNA聚合酶要求不高，一般來說，只要提供足夠的模板量（<1 000 ng），1.0～1.5 U（20 μL體系）都會得到穩定的條帶；但2者濃度過高不僅浪費還會導致非特異性擴增產物積累[7]。

PCR反應條件中影響最大的是Mg2+、dNTPs與引物的濃度[7]，在RAPD-PCR各因素濃度水平互相作用中，高Mg2+、低dNTPs濃度，以及低Mg2+、高dNTPs濃度條件不能擴增出條帶或產生極弱的條帶，因為dNTPs過早被消耗完，使產物單鏈化，甚至得不到產物；而過量的dNTPs對Mg2+的螯合作用明顯，從而降低了依賴于Mg2+的TaqDNA聚合酶的活性，也不能擴增出條帶[8-10]；而在ISSR-PCR中，Mg2+濃度太低時，不管引物和dNTPs濃度如何，均不能成功擴增，表明了Mg2+在擴增中的重要性。

堿基長度決定了引物的退火溫度，RAPD中隨機引物大多為10個堿基，退火溫度一般為36 ℃，過低會導致引物與模板非特異性結合，引起擴增的特異性下降[11-12]；但過高，如大于 40 ℃ 時會抑制反應，導致無片段。ISSR引物大多數為 15～20個堿基長度，比隨機引物多，適合較高的退火溫度，并且能提高ISSR-PCR反應的特異性及精確度。

參考文獻：

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