馬拉硫磷手性對映體在大鼠體內的代謝研究

摘要：用高效液相色譜法建立馬拉硫磷手性農藥對映異構體的拆分檢測方法，以大鼠為研究對象，分為空白對照組（C）和試驗組（T）。C組灌胃生理鹽水2 mL/只，試驗組灌胃馬拉硫磷700 mg/kg后，分15、30、60、120 min分別采大鼠血漿、心臟、肝臟等樣品，測定所有試驗鼠血漿、組織中馬拉硫磷對映體含量的變化情況，用EF（對映體分數）表示。通過口服途徑對大鼠進行馬拉硫磷對映體分析方法的建立及選擇性代謝行為研究。結果表明，馬拉硫磷對映體在大鼠血漿和組織中代謝存在明顯的立體選擇性，且R-構型較S-構型活性高。

關鍵詞：馬拉硫磷；大鼠；對映體分數

中圖分類號： O657.7+2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0306-03

收稿日期：2013-11-27

基金項目：廣東省科技計劃（編號：2011B040300015）。

作者簡介：吳艷（1983—），女，安徽蚌埠人，碩士研究生，工程師，主要從事化學分析，色譜分析等方面的研究。E-mail：gyswuyan@163.com。有機磷手性農藥被作為殺蟲劑和殺菌劑廣泛應用，對映異構體具有幾乎完全相同的物理化學性質，但是其生物活性、毒性、代謝、殘留等行為差別較大。但由于手性農藥的特殊性，對映體選擇性的轉化及代謝行為還是人們比較陌生的領域，因此對映體的檢測和代謝行為引起了人們廣泛的關注。

馬拉硫磷是目前廣泛使用的手性農藥，具有多種毒性效應，包括神經毒性、遺傳毒性、免疫毒性和生殖毒性[1-2]等。目前對于馬拉硫磷的水解，以及在土壤中的降解等行為已經研究得較為清楚，有關毒性、毒理方面的研究也已有很多報道。對于以高效液相色譜法建立馬拉硫磷手性農藥對映異構體的殘留檢測方法，通過測定血樣及組織中對映體含量的變化情況，最終確定對映體的選擇性代謝行為。本研究探討了農藥對人類健康潛在危害的成因，為合理使用農藥、制定相關食品安全法規提供依據。

1材料與方法

1.1主要儀器和藥劑

安捷倫-1100型高效液相色譜儀，配有四元泵；RE-52AA型旋轉蒸發儀；馬拉硫磷標準儲備液濃度為100 mg/L，由農業部環境保護科研監測所提供。無水硫酸鈉（分析純），乙酸乙酯、乙腈（美國天地）、異丙醇及正己烷為色譜純；用前過0.45 μm濾膜，去離子三蒸水。

1.2馬拉硫磷手性拆分與定量

手性拆分由高效液相色譜儀完成，每次分離進樣量 10 μL，手性色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為纖維素三苯甲酸酯（CDMPC，由本實驗室自制）[3-4]，流動相為正己烷 ∶異丙醇=95 ∶5（體積比），流速0.8 mL/min，紫外檢測波長254 nm，檢測器進行定量分析。以保留時間定性，峰面積外標法定量[5-6]。柱溫15 ℃，配制濃度為0.30、1.65、3.03、1510、30.30、151.00 μmol/L 的馬拉硫磷標準溶液，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得出標準曲線，根據標準曲線擬合計算出馬拉硫磷對映體的濃度。采用峰高定量，高效液相色譜測試稀釋的標準樣品，以噪聲的3倍計算出農藥的最小檢測靈敏度。

1.3動物試驗和分組

1.3.1試驗動物及分組35只清潔級雄性 SD大鼠，體重 200 g左右，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心。飼養環境溫度（20.0±1.0）℃，濕度 50%～60%，自由飲水進食。35只大鼠預飼1周后，分為空白對照組（C），C組灌胃生理鹽水 2 mL/只；試驗組共分4組，每組7只大鼠。試驗組灌胃馬拉硫磷700 mg/kg后，（1）T1：處理后15 min；（2）T2：處理后 30 min；（3）T3：處理后60 min；（4）T4：處理后120 min；采大鼠血漿、心臟、肝臟等，-20 ℃備用。

1.3.2樣品處理移取5 mL血漿于50 mL聚丙烯離心管中，加入30 mL乙腈-正己烷（1 ∶1）溶液，渦旋振蕩提取 30 min，6 000 r/min，離心5 min，上清液轉入250 mL分液漏斗中，另用30 mL乙腈-正己烷（1 ∶1）提取殘留物，合并提取液。用40 mL正己烷與40 mL飽和NaCl溶液萃取。靜置分層后，收集正己烷層（無水硫酸鈉干燥），旋轉蒸發儀濃縮至 4 mL，再用乙腈提取3次，棄去正己烷層，并收集乙腈層，旋轉蒸發儀干燥后0.5 mL正己烷定容，過0.45 μm濾膜后取20 μL進樣。組織樣品勻漿后，稱取5 g樣品勻漿液于50 mL聚丙烯離心管中，后續處理方法同上血漿前處理方法。

1.4統計處理

采用對映體分數EF值作為馬拉硫磷手性對映體選擇性變化的指標[7]，EF=E1/（E1+E2）。E1和E2分別表示第1個出峰的對映體與第2個出峰的對映體的峰面積。EF值的變化范圍在0～1.0之間，EF=0.5表示外消旋體。所得到的EF值偏離外消旋體標樣的EF值越遠，表明馬拉硫磷對映體在樣本中的立體選擇性行為越明顯。本研究中E1代表R-構型，E2代表S-構型。

2結果與分析

2.1馬拉硫磷的HPLC色譜分析

馬拉硫磷經自制纖維素三苯甲酸酯（CDMPC）手性固定相色譜柱，8 min內分離成2個峰，經圓二色檢測器[8-9]，確定2個對映體流出先后順序為先流出的是右旋，后流出的是左旋。在0.3～151.0 μmol/L的范圍內，2個對映體峰面積與濃度呈線性關系，相關系數為0.999 3、0.999 6。最低檢測限為 81.2 nmol/L，檢測靈敏度高。配制15.1 μmol/L的馬拉硫磷測定的右旋、左旋對映體的日內、日間精密度分別為337%、521%和4.24%、5.53%，均在6%以內，精密度符合要求，測定方法可靠，可以作為定量的依據，結果見表1。馬拉硫磷在大鼠血漿、心臟和肝臟等組織中的回收率分別為7375%～119.95%，結果見表2。

3討論

一般認為，有機磷農藥中毒主要機理是抑制乙酰膽堿酯酶的活性，引起中樞神經調節功能紊亂、神經過分刺激、沖動不能休止，造成機體痙攣、癱瘓等一系列神經中毒癥狀，甚至死亡。

手性化合物對映體在代謝過程中的立體選擇性表現在吸收、分布、代謝和消除的整個過程中，這種選擇性來源于手性藥物與生物體內的手性環境及內源性手性分子的相互作用。手性農藥在體內，可能受酶系統或消化道菌叢的作用發生結構性生物轉化。

本研究中，經口服灌胃外消旋馬拉硫磷后，在大鼠體內表現出明顯的立體選擇性藥代動力學行為和降解特征，用藥后1 h內，2對映體在血漿中的濃度差異很大，EF值趨于1，表明S-構型在代謝過程中消失。造成這種現象最有可能的原因就是對映體發生了轉化。在藥物進入血液中后，由于某種酶的作用，馬拉硫磷左旋體發生轉化，迅速轉化成對映體右旋體，相關機理還有待于進一步深入研究。

藥物代謝可以從體內消除，也可進一步代謝。大多數代謝在肝中進行，也有在其他器官代謝。從各組織中EF含量可見，在心臟和肝臟組織中R-構型的含量也是一直高于S-構型的，隨時間的增加EF值趨于穩定。由此可以推斷出馬拉硫磷的毒性與構型相關，且R-構型起主要作用。本結論也與一般認為有機磷殺蟲活性與對動物的毒性相關，R-構型較S-構型具有更高的活性的結論相符[11]。本研究結果馬拉硫磷對映體在大鼠血漿和組織中代謝存在明顯的立體選擇性，且R-構型較S-構型活性高，S-構型不穩定，易降解轉化。

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