鯽魚腸道中枯草芽孢桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

摘要：從鯽魚腸道中分離純化獲得1株革蘭氏陽性菌，編號為CB-1，通過細菌形態學觀察、理化特性等研究，初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌株能利用葡萄糖產酸，β-半乳糖苷、明膠液化試驗為陽性，葡萄糖酸鹽、硫化氫、吲哚試驗等為陰性；藥敏試驗結果表明，CB-1菌株對頭孢噻吩、卡那霉素、阿奇霉素等抗生素敏感，對潔霉素、甲硝唑、制霉菌素等不敏感。為進一步研究枯草芽孢桿菌與魚類健康養殖關系提供參考。

關鍵詞：鯽魚；腸道細菌；枯草芽孢桿菌；分離鑒定；藥敏試驗

中圖分類號： S917.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0244-02

收稿日期：2013-10-02

基金項目：國家自然科學基金（編號：31272692、30800847），江蘇省高校重點專業類建設項目（編號：2012-2015）。

作者簡介：李旭（1992—），男，江蘇徐州人，主要從事水產動物微生物學研究。

通信作者：呂愛軍，副教授，主要從事微生物及免疫學研究，E-mail：lajand@126.com。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種短桿狀、無莢膜能運動的革蘭氏陽性細菌，能產中生芽孢，廣泛分布于土壤、湖泊、海洋、動植物體表及其棲息地[1]。2003年，我國農業部公布了能夠用于生產微生態制劑菌種包括：枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）等[2]。最近，白延琴等從秸稈垛底層土壤中分離得到1株枯草芽孢桿菌[1]。周金敏等從黃顙魚腸道中篩選出1株益生性芽孢桿菌[3]，結果表明，枯草芽孢桿菌的抗逆性及在消化道中穩定性強于其他益生菌。馬如龍等研究斜帶石斑魚幼魚腸道的優勢菌為芽孢桿菌，對石斑魚生長和健康具有促進作用[4]。本研究以鯽魚腸道細菌為主要研究對象，從中分離純化獲得1株芽孢桿菌，并進行了染色特性、菌體形態、生理生化特性及藥敏反應等研究，以期為鯽魚腸道細菌的鑒定、微生態制劑開發等提供依據。

1材料與方法

1.1材料

鯽魚購自江蘇省徐州市某市場，體重約100 g。普通瓊脂培養基、細菌生化微量鑒定管及藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1腸道細菌的分離與鑒定參考呂愛軍等方法[5]進行，將新鮮鯽魚腸道中的菌液，均勻涂布在普通瓊脂平板，30 ℃ 恒溫培養24 h后，挑取典型單菌落，采用平板劃線法，純化傳代2～3次，轉種于4 ℃冰箱保藏、備用。細菌生理生化特性試驗等按常規方法進行，分別挑取單菌落涂片進行革蘭氏染色及孔雀綠芽孢染色，鏡檢觀察分離菌株的染色及形態特征。

1.2.2藥敏試驗采用紙片擴散法，用無菌操作將紙片置于接種分離菌株的普通瓊脂平板，置于30 ℃溫箱中培養24 h后，量取抑菌圈的直徑，根據藥敏試驗判斷標準書，確定該菌對不同藥物的敏感程度。

2結果與分析

2.1菌落及形態特征

從鯽魚腸道中分離純化獲得1株細菌，暫時編號為CB-1，接種于普通瓊脂平板30 ℃恒溫培養24 h后，形成表面干燥、褶皺、扁平、不透明、乳白色、邊緣不整齊、直徑2～5 mm的中大菌落；CB-1菌株為革蘭氏陽性大桿菌，產芽孢，芽孢呈橢圓、中生狀（圖1）。

2.2生理生化特性

細菌生理生化試驗結果，分離菌CB-1菌株葡萄糖酸鹽利用試驗、硫化氫產生試驗、吲哚產生試驗及MR試驗為陰性，可利用葡萄糖產酸不產氣，不能還原硝酸鹽、水解淀粉、分解尿素，不能產生脫羧酶利用賴氨酸、鳥氨酸脫羧生成胺和二氧化碳；β-半乳糖苷、明膠液化試驗為陽性。對CB-1菌株進行形態學觀察、生理生化特性分析，發現與《常見細菌系統鑒定手冊》[6]描述基本一致，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。

2.3藥敏試驗

采用26種抗生素對CB-1菌株進行藥敏試驗，測量抑菌圈直徑，計算平均值。結果表明，CB-1菌株對頭孢菌素類（頭孢噻吩、頭孢哌酮、先鋒霉素Ⅳ）、氨基糖甙類（丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素、氯霉素、乙基西梭霉素）、大環內酯類（阿奇霉素、紅霉素）等抗生素敏感；對潔霉素、甲硝唑、制霉菌素等不敏感（表1）。

3討論

國內對鯽魚腸道中枯草芽孢桿菌的分離鑒定，尚未見相關文獻報道。近年來，枯草芽孢桿菌在水產養殖上作為飼料添加劑已被廣泛應用。Munro等發現魚類腸道菌群主要來源于所攝取的活飼料而不是養殖水體[7]。邱燕等通過添加適量枯草芽孢桿菌，發現可改善草魚腸道黏膜形態，促進草魚對營養物質的吸收利用[8]。江永明等在飼料中添加枯草芽孢桿菌，能顯著促進奧尼羅非魚的生長[9]。趙士豪等利用大腸桿菌為抑菌對象分離到4株芽孢桿菌，研究高效復合益生菌來替代抗生素，減少抗生素對魚類養殖的不利影響[10]。唐家毅等從水產養殖環境中篩選出1株芽孢桿菌能夠有效降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮[11]。丁祥力等分離1株枯草芽孢桿菌，可有效改善淡水養殖水體的水質[12]。賀剛等從草魚腸道分離出1株枯草芽胞桿菌并進行藥敏試驗，結果表明，該菌株對諾氟沙星、頭孢哌酮、慶大霉素等抗生素高度敏感[13]。本研究從鯽魚腸道中分離純化出1株枯草芽孢桿菌，藥敏試驗結果表明，CB-1菌株對諾氟沙星、頭孢哌酮、慶大霉素等敏感，本研究結果與已有報道結果基本一致[13]。關于鯽魚腸道中枯草芽孢桿菌的16S rDNA基因分子鑒定及微生態制劑研制，還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1]白延琴，辛小玲，來有志，等. 枯草芽孢桿菌的分離篩選[J]. 畜牧獸醫雜志，2013，32（2）：24-31.

[2]徐海燕，曹斌，辛國芹，等. 一株芽孢桿菌的分離鑒定及其益生潛質分析[J]. 家畜生態學報，2012，33（3）：48-53.

[3]周金敏，吳志新，曾令兵，等. 黃顙魚腸道病原拮抗性芽孢桿菌的篩選與特性研究[J]. 水生生物學報，2012，36（1）：78-84.

[4]馬如龍，楊紅玲，孫云章，等. 2株漁源芽孢桿菌的生物學特性研究[J]. 水產科學，2010，29（9）：505-509.

[5]呂愛軍，楊正行，劉歡，等. 斑馬魚腸道細菌的分離與生理生化特性[J]. 中國農學通報，2010，26（24）：412-415.

[6]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001.

[7]Munro P D，Barbour A，Birkbeck T H. Comparison of the gut bacterial flora of start feeding larval turbot rearedunder different conditions[J]. Journal of Applied Bacteriology，1994，77（5）：560-566.

[8]邱燕，蔡春芳，戴小芳，等. 枯草芽孢桿菌對草魚生長性能與腸道黏膜形態的影響[J]. 中國飼料，2010（19）：34-36.

[9]江永明，付天璽，張麗，等. 微生物制劑對奧尼羅非魚生長及消化酶活性的影響[J]. 水生生物學報，2011，35（6）：998-1004.

[10]趙士豪，楊會琴，趙春海. 益生菌芽孢桿菌的分離與初步鑒定[J]. 中國農學通報，2012，28（18）：271-275.

[11]唐家毅，劉婕，于鐵妹，等. 一株水產芽孢桿菌的鑒定及其培養基優化的研究[J]. 淡水漁業，2008，38（6）：26-30.

[12]丁祥力，王震，陳薇，等. 枯草芽孢桿菌WH-5的分離鑒定及凈水研究[J]. 湖南農業科學，2012（1）：15-19.

[13]賀剛，何力，王朝元，等. 草魚腸道枯草芽孢桿菌的耐藥性分析[J]. 現代農業科技，2008（22）：219-222.