集成聯合用藥、隔離早期斷奶SEW和“三點式”生產體系培育豬氣喘病陰性群

摘要：為探索豬肺炎支原體陰性群的培育方法，本試驗研究了集成聯合用藥、SEW和“三點式”飼養管理體系等技術對豬肺炎支原體的凈化效果。先通過妊娠母豬的篩選，母豬程序性用藥，SEW技術，屏障隔離系統，“三點式”生產飼養管理體系及仔豬程序性用藥的培育方法，再通過豬肺炎支原體血清抗體檢測和熒光定量PCR檢測鼻拭子的方法對所培育的仔豬進行長達4個月的監測，結果發現新培育的5批豬在35日齡后血清抗體均為陰性，鼻拭子抗原檢測全為陰性。結果表明集成聯合用藥、SEW和“三點式”生產管理體系技術可以有效凈化豬肺炎支原體，為國內豬氣喘病的控制和凈化提供理論基礎及臨床實踐經驗。

關鍵詞：SEW；早期斷奶；屏障系統；“三點式”生產飼養管理體系；藥物凈化；生物安全

中圖分類號： S852.3；S858.286.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0197-04

收稿日期：2013-12-20

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（13）3076]。

作者簡介：甘源（1984—），男，湖北荊州人，碩士，從事動物重大疫病研究。E-mail：ganyuan19868@163.com。

通信作者：邵國青，研究員。E-mail：gqshaojaas@gmail.com。豬支原體肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）又稱豬地方流行性肺炎、豬氣喘病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）感染引起的一種慢性呼吸道傳染病，也是世界上最主要的豬病之一[1]，以咳嗽、喘氣和生長發育遲緩為主要臨床特征[2]。Mhp可通過直接接觸或氣溶膠傳播[3-4]，其傳播距離可達4.7 km[5]，極難防控。美國豬場45%的防疫費用于購買豬支原體肺炎滅活疫苗，但仍不能完全控制。近幾年來，我國養豬業向集約化、規?；l展速度迅猛，由于國內大多數豬場管理不到位，生物安全重視程度不夠，區域內豬場密度大，豬場內養殖密度大、生豬運輸頻繁等因素，加大了豬肺炎支原體的傳播和感染，不僅降低各種參數，如降低飼料報酬延長了感染豬至出欄體重的生長時間，而且導致抗生素濫用，加大了養豬成本和給食品安全帶來危害，給養豬業帶來巨大的損失。如何經濟有效地控制豬氣喘病一直是困擾全球養豬業的難題，研究表明控制該病的最好方法是從源頭抓起徹底凈化病原。

早在1970年Juhr等就報道了無支原體肺炎的實驗動物的控制方法[6]，20世紀70年代末至80年代初，英國Alerander等也創造了一種消滅豬病的新方法-MEW技術（治療性早期斷奶技術），緊接著20世紀90年代初期美國養豬界Dritz等又試行了一種隔離式早期斷奶技術（segregated early weaning，SEW）。目前，美國60%的豬群都推行SEW，在日本和我國的臺灣省、廣東省也都進行了嘗試。紀孫輝等的研究表明，用早期隔離斷奶技術能使支原體陽性率下降68%[7]，說明使用SEW技術對防控豬氣喘病有一定的效果，但并不能徹底凈化病原，需要其他技術的輔助。后來國內外研究又探索了一些支原體的凈化方法，其中瑞士減群法、程序性用藥、早期藥物隔離斷奶技術和封群等技術比較流行[8]。西歐很多豬場在實施瑞士減群法凈化Mhp時就用以延胡索酸泰妙菌素為主的用藥方案。Alfonso等利用藥物早期隔離斷奶技術聯合多點式生產模式成功凈化了一個1 700頭母豬豬場的肺炎支原體[9]，而這些方法最關鍵的是制定科學合理的凈化措施。

針對目前豬肺炎支原體防控日益嚴峻的形勢，本研究在結合對豬肺炎支原體防控及致病機理研究成果的基礎上，借鑒前人的研究經驗，聯合運用MEW及“三點式”生產體系培育豬氣喘病陰性群，通過為健康種豬核心群提供豬氣喘病陰性種豬，從源頭上控制和凈化豬氣喘病，為國內豬氣喘病的防控和凈化提供理論基礎和實踐經驗。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要設備屏障系統：正壓無菌動物房及隔離飼養器（江蘇省農業科學院實驗動物中心）；7500實時熒光定量PCR儀（美國Life Technologies公司）；無菌奶槽；排泄物處理裝置；乳豬無菌運輸箱等。

1.1.2主要試劑豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒、豬藍耳病ELISA抗體檢測試劑盒、豬偽狂犬gE ELISA抗體檢測試劑盒和豬肺炎支原體血清抗體檢測試劑盒購自美國愛德士生物科技公司；豬圓環病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前動物生物制品有限責任公司；口蹄疫ELISA抗體檢測試劑盒購自韓國金諾；Premix Ex TaqTM為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.1.3試驗動物每批次選擇常州某豬場3胎以上妊娠中期，支原體抗原抗體為陽性的無臨床癥狀母豬和所產仔豬若干頭。 共選取5批次。

1.1.4菌株及質粒載體Mhp菌株由江蘇省農業科學院獸醫研究所家畜重大疫病組保存。重組質粒pMD18-T/P97由江蘇省農科院獸醫研究所家畜重大疫病組制備。

1.1.5主要飼料和藥品市售配方奶粉、教槽料購自江蘇安佑科技飼料有限公司；80%泰妙菌素和鹽酸多西環素購自上海諾華動物保健有限公司；復合電解多維、甲醛、聚維酮碘、2%過氧乙酸、生石灰、葡萄糖水為常規藥品或試劑。

1.2方法

1.2.1“三點式”飼養模式飼養地點的選擇及生物安全管理采用“三點式”生產體系[10-12]飼養技術和部分SPF管理技術[13]：其中A地點是支原體陽性場，B地點為正壓無菌動物房及隔離飼養器，C地點為無疫病且具有優良的地理性隔離飼養點，根據最新研究發現豬肺炎支原體病原的傳播距離可遠至4.7 km[5]，固A、B、C這3個地點相距直線距離不少于 5 km 且飼養點周圍5 km之內沒有其他豬場和屠宰場，每個飼養點遠離交通要道和人物流動性大的區域以避免引進新的病原，以針對飼養管理建立一個綜合的生物安全體系（圖1）。

1.2.2陽性A場母豬群的篩選及產前預處理采集假定支原體肺炎陽性場的妊娠母豬群的血樣和鼻拭子樣本，通過熒光定量PCR及ELISA方法篩選抗原抗體陽性母豬群，確定試驗動物來源，確定的支原體陽性場設定為A場；在A地點選擇妊娠后期母豬，豬肺炎支原體陽性種豬群于產前20 d給藥，80%泰妙菌素125 g/t+鹽酸多西環素150 g/t +阿莫西林200 g/t，連續用藥2周，產前1周停藥。接產室每天用聚維酮碘500倍液噴霧消毒3次。預產前母豬全身消毒后送入消毒好的產房待產，并認真做好初乳仔豬的日常護理工作。在A場每批次隨機挑選不做以上處理的母豬分娩的仔豬共10頭設為對照組，標記、樣品采集、抗原抗體檢測（監測）同步進行。

1.2.3運用SEW獲得仔豬在B地點隔離屏障系統內的飼養管理從陽性A地點挑選出健康狀況良好的7日齡仔豬，采用無菌轉運箱轉移至遠離母豬源的B地點隔離飼養，B地點的飼養環境為安裝空氣過濾屏障系統房間，并嚴格控制溫濕度，嚴格執行隔離器飼養仔豬的日常管理制度。在轉群和飼養的過程中嚴格消毒并注意生物安全，遵照飼養管理程序做好日常保健及除豬肺炎支原體外的其他疫苗免疫工作，補鐵補鋅、打耳號等。在飼養期間給予豬肺炎支原體敏感抗生素藥物凈化，即：1 L安佑產“奶媽奶”或1 kg教槽料中拌藥：80%泰妙菌素1 g+電解多維4 g，連用直至35日齡轉群至C地點。

1.2.4C地點隔離飼養方式遵照抗原抗體檢測（監測）結果，從B地點挑選出健康狀況良好的35日齡的仔豬，采用無菌轉運箱轉移至C地點隔離飼養，C地點安排有飼養經驗的專人駐點飼養，在轉群和飼養的過程中嚴格消毒并注意生物安全，遵照飼養管理程序做好日常保健及除豬肺炎支原體外的其他疫苗免疫工作。

1.2.5具體藥物凈化程序的制定及實施方法A地點：所有種豬（種公豬和種母豬）：1 t飼料中拌藥：80%泰妙菌素 125 g+15%金霉素2 000 g +電解多維400 g，產前20 d給藥，連續用藥2周，產前1周停藥。B地點：7日齡早期斷奶直至35日齡轉群，1 L“代母乳”或1 kg教槽料中拌藥：80%泰妙菌素 1 g+電解多維4 g，連用直至35日齡轉群至C地點。C地點：所有豬群，1 t飼料中拌藥：80%泰妙菌素125 g+電解多維400 g，轉群后連用7 d后停藥，每月月初用藥7 d，擴繁用種豬產前和配種前1周停藥。

1.2.6豬肺炎支原體血清抗體檢測A場對照組和B場、C場試驗組于21、35、75、120日齡采集血樣，運用血清學方法，即：運用美國IDEXX ELISA檢測試劑盒監測血清中豬肺炎支原體特異性抗體。淘汰抗體陽性豬群。以后每隔1個月用同樣方法采集樣品進行監測。如有抗體陽性群，則整窩淘汰。另外，嚴格按操作說明檢測豬瘟、藍耳病、偽狂犬等疫苗抗體，如果有不符合要求的豬只及時補打疫苗或者淘汰處理。

1.2.7豬肺炎支原體鼻拭子樣品抗原檢測按照“1.2.6”的時間同步采集鼻拭子樣品，運用分子生物學方法，即：按馮志新等的方法[14]處理鼻拭子樣品，用已建立的熒光定量PCR[15]檢測豬肺炎支原體病原監測鼻拭子中的豬肺炎支原體病原。淘汰病原陽性群。以后每隔1個月用同樣方法采集樣品檢測（監測）1次。如有陽性群，則整窩淘汰。

1.2.8日常管理建立完善的日常記錄臺賬及定期對試驗豬群的血清學及分子生物學檢測（監測）結果進行整理，建立凈化檔案，每一次轉群都做到全進全出。每周定期對飼養環境進行徹底清洗消毒，使用3種消毒液交替使用，定期滅鼠滅蚊，全群驅蟲。

1.2.9豬肺炎支原體凈化方法本次研究豬肺炎支原體凈化方法如圖1所示。

2結果與分析

2.1培育豬群和對照豬群樣品抗原檢測結果

定期對上述5批培育豬和對照豬群所采集的血清和鼻拭子樣品進行檢測（監測），由表1可知試驗豬群的抗原檢測（監測）結果全為陰性，對照豬群抗原檢測結果全為陽性，表明該凈化方法可以有效切斷支原體病原的水平和垂直傳播。

2.2培育豬群和對照豬群的樣品抗體檢測（監測）結果

3.3運用程序性用藥、SEW和“三點式”生產體系技術培育豬氣喘病陰性群的關鍵點

本方法對仔豬7日齡進行早期隔離斷奶后就將其轉入正壓無菌動物房內的物理性隔離器內飼養，使用的隔離器特征在于三級空氣凈化屏障系統為高效正壓系統，通過三級高效的0.2 μm的通風過濾膜將攜帶豬肺炎支原體的氣溶膠屏障在外，屏障系統特點為：能夠很好地控制溫濕度，投喂飼料、糞便收集、消毒及清理方便，對豬肺炎支原體凈化具有很好的效果，大大降低了豬群通過呼吸攜帶致病因子的氣溶膠而感染豬肺炎支原體的概率；但在實際生產中很難有這樣的潔凈條件，我們將在下一步的試驗中遵循實際推廣的要求逐一簡化。

生產出豬氣喘病陰性群后，對它的維持至關重要。國內外凈化支原體的技術難點及凈化失敗的原因并不在生產豬氣喘病陰性群上，主要是在陰性群維持上[16]，它是一個復雜、長期和艱巨的任務。維持的技術手段主要有科學的飼養管理體系、藥物控制及疫苗免疫這三方面內容。同時良好的地理隔離環境和生物安全保障也是成功凈化豬肺炎支原體的一個重要因素。

在對于陽性母豬群降低或減少對下一代仔豬的疫病垂直傳播和水平傳播的方法上，國內也有不少專家做過各種相應的研究，袁國華等利用自然分娩的方法也能夠有效阻止豬肺炎支原體病原的傳播[17]，這些方法都是基于不同疫病母源抗體為仔豬提供的被動免疫保護能力持續時間不同來實施的。而只有在母源抗體的有效保護時間內斷奶并隔離飼養，才能切斷病原的垂直傳播。

最后，在建立本研究方法之前，我們建立了詳盡的試驗方案、優良的試驗條件及相關的準備工作。從本試驗結果來看，運用程序性用藥、SEW和“三點式”生產體系技術培育豬氣喘病陰性群的方法是可行的，此研究為豬肺炎支原體的凈化提供了新的方法及事實論證。我們下一步研究計劃是在推廣該方法的同時繼續簡化各種操作程序及降低運行成本，以便更易于該方法的實際推廣與運用。

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